一種固定化核酸酶P1及其制備方法與其應用技術

本發明專利技術公開了一種固定化核酸酶P1的制備方法，包括如下步驟：(1)改性樹脂：以表面修飾劑改性介孔樹脂，得到表面改性的介孔樹脂載體，所述的表面改性劑為伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一種或幾種的混合物；所述的介孔樹脂為環氧基樹脂、氨基樹脂、磺酸基樹脂或者羧基化樹脂；(2)核酸酶P1固定化：將步驟(1)得到的介孔樹脂載體加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1與樹脂的質量比為10～250mg：1g，混合，在25℃振蕩反應時間2～12h，抽濾得到樹脂固定化核酸酶P1。本發明專利技術提供的表面改性介孔樹脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率達到95％以上。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程
，具體設計一種固定化核酸酶P1及其制備方法與應用。
技術介紹
近年來，由于生物催化反應具有底物特異性、反應效率高等優勢而備受關注。然而生物酶在工業環境下穩定性差、耐受性差、重復利用性差及分離困難，難以實現連續化。而解決酶催化工業應用的關鍵技術就是固定化。核苷酸具有很高的經濟價值，廣泛應用于生物醫藥、食品、飼料和營養保健等領域。目前生產核苷酸的方法有水解法、微生物發酵法、化學合成法及自溶法等，化學合成法著重于核苷的磷酸化，生產成本高效率低，且用到有毒的化工原料，與提倡綠色產品的理念相違背；微生物發酵法生產成本低效率高，但核苷酸生產難度較大，目前僅有肌苷酸和鳥苷酸實現了工業化生產；自溶法產物濃度低，總收率較低，提取困難；酶解法利用酶水解RNA，該方法生產核苷酸成本低、收率高、操作簡單，是目前主要的核苷酸生產方法。核酸酶P1是一種含鋅金屬酶，由桔青霉發酵生成，具有磷酸二酯酶特性，能將單鏈DNA和RNA水解為5’-核苷酸，是核苷酸工業化生產中最常用的一種酶。研究表明游離酶利用率低、產物底物雙抑制、產品分離純化困難，導致工業生產中難以實現連續化，因此固定化酶連續生產核苷酸的研究成為重點。樹脂作為一種人工合成的介孔多聚物，具有機械強度高、穩定性好、載酶量大、易于分離、可重復使用等優點，已經被廣泛用作固定化酶載體。然而該固定酶存在固定量及酶活性偏低、穩定性不夠等問題，因此需要選擇合適的表面修飾劑對樹脂表面進行改性以提高固定化酶的固載量、酶活性及熱穩定性。伴刀豆蛋白A(ConA)作為一種凝集素，對含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特異性的親和力，實現酶的定向固定化，使酶在載體表面按照一定的方向排列，使底物易進入到酶的活性位點，從而改善酶的酶學性質。利用戊二醛將ConA和載體交聯在一起，然后核酸酶P1的糖基部分和ConA連接起來，通過核酸酶P1的糖基部分實現酶的定向固定化，沒有必須氨基酸殘基參與共價結合，且避免了固定化過程中由于酶分子與交聯劑直接接觸對酶分子造成的化學損傷。聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)簡稱PVP，是一種非離子型水溶性高分子化合物，由N-乙烯基吡咯烷酮在一定條件下聚合而成，由于其良好的水溶性、化學穩定性、生物相容性和生物惰性，在材料表面改性中逐漸表現出較好的應用前景。PVP改性載體表面具有良好的抗蛋白質吸附能力，選擇性的吸附特定的蛋白，且PVP的包覆和空間位阻作用可抑制酶的團聚，使酶在載體表面均勻分布，進一步提高酶的穩定性。聚乙二醇(PEG)分子末端有兩個能被活化的-OH基團，能夠與水形成氫鍵，使其具有良好的水溶性，是一種被廣泛使用的化學修飾材料。PEG無毒、無免疫原性、具有良好的生物相容性，且其生物相容性已通過美國食品和藥物管理局(FDA)認證。多巴胺是一種生物神經遞質，具有優良分散性、粘附性、親水性及生物相容性等優點,在堿性有氧條件下可在幾乎所有材料表面發生自聚合反應，形成一層強力黏附在固體材料表面的聚多巴胺層，成為用于酶固定化領域的一種理想材料。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是，提供一種固定化核酸酶P1，以解決現有技術中游離酶利用率低、產物底物雙抑制、產品分離純化困難的問題。本專利技術還要解決的技術問題是提供上述固定化核酸酶P1的制備方法。本專利技術最后要解決的技術問題提供上述固定化核酸酶P1在水解RNA制備核苷酸中的應用。為解決上述技術問題，本專利技術提供如下技術方案：一種固定化核酸酶P1的制備方法，包括如下步驟：(1)改性樹脂：以表面修飾劑改性介孔樹脂，得到表面改性的介孔樹脂載體，所述的表面改性劑為伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一種或幾種的混合物；所述的介孔樹脂為環氧基樹脂、氨基樹脂、磺酸基樹脂或者羧基化樹脂；(2)核酸酶P1固定化：將步驟(1)得到的介孔樹脂載體加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1與樹脂的質量比為10～250mg:1g，核酸酶P1與樹脂的質量比優選100mg:1g，在25℃振蕩反應時間2～12h，抽濾得到樹脂固定化核酸酶P1。步驟(1)中，利用伴刀豆蛋白改性介孔樹脂的方法如下：(1a)伴刀豆蛋白活化：將伴刀豆蛋白溶于緩沖液中，所述的緩沖液包括如下組分：0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2、0.1mol/LKH2PO4、0.1mol/LK2HPO4、pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；(1b)戊二醛活化介孔樹脂：將50～200g介孔樹脂加入400mL、0.1mol/LpH8.0的磷酸緩沖液，攪拌15～60min，得到戊二醛活化的介孔樹脂；(1c)伴刀豆蛋白修飾介孔樹脂：將戊二醛活化的介孔樹脂加入伴刀豆蛋白溶液中，在25℃、150rmp下震蕩6～18h，去除上清，水洗介孔樹脂，得到伴刀豆蛋白修飾的介孔樹脂。步驟(1)中，利用聚乙二醇、聚多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮改性介孔樹脂的方法如下：(2a)配制改性劑溶液：0.05～5g/g聚乙二醇溶液、0.1～3g/L鹽酸多巴胺Tris溶液、1～5g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液；(2b)取1～5g介孔樹脂于反應容器中，加入50～300mL相應的改性劑溶液，置于25℃、120～180rmp恒溫搖床中震蕩，去除上清，水洗介孔樹脂，得到改性的介孔樹脂。步驟(2)中，所述的核酸酶P1的氨基酸序列如SEQIDNO.：1所示。上述述固定化核酸酶P1的制備方法制備得到的樹脂固定化核酸酶P1在本專利技術的保護范圍之內。上述樹脂固定化核酸酶P1在水解RNA制備核苷酸中的應用在本專利技術的保護范圍之內。本專利技術所提供的表面改性的樹脂微球可以用于固定化核酸酶P1，進行連續催化水解RNA制備核苷酸，實驗表明，本專利技術制備的固定化酶可使RNA的轉化率保持在95％以上。本專利技術的優點和有益效果在于：(1)本專利技術提供的介孔樹脂微球表面改性方法工藝簡單，利用表面改性介孔樹脂微球固定化酶效果明顯；(2)本專利技術提供的表面改性介孔樹脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率達到95％以上；(3)本專利技術提供的表面改性介孔樹脂微球固定化方法，核酸酶P1性質穩定，可重復使用。附圖說明圖1是本專利技術的介孔樹脂微球形貌結構表征的FESEM圖譜。通過FESEM表征可看出樹脂微球樣品呈球狀形貌，直徑約0.5mm。圖1(b)為樹脂微球橫截面的FESEM圖，可見微球內部結構蓬松、孔道豐富。圖1(c，d)分別是對微球表面和截面的放大，可清晰看出孔道和內部多孔結構的存在。圖2是戊二醛活化的介孔樹脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA-E的FTIR圖。圖3是戊二醛活化的介孔樹脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA-E的熱重分析圖。圖4是戊二醛活化的介孔樹脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA-E的氮氣吸附-脫附等溫線。圖5是戊二醛活化的介孔樹脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修飾的介孔樹脂HA-GA-ConA本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種固定化核酸酶P1的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)改性樹脂：以表面修飾劑改性介孔樹脂，得到表面改性的介孔樹脂載體；其中，所述的表面改性劑為伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一種或幾種的混合物；所述的介孔樹脂為環氧基樹脂、氨基樹脂、磺酸基樹脂或者羧基化樹脂；(2)核酸酶P1固定化：將步驟(1)得到的介孔樹脂載體加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1與樹脂的質量比為10～250mg：1g，混合，在25℃振蕩反應時間2～12h，抽濾得到樹脂固定化核酸酶P1。

【技術特征摘要】
1.一種固定化核酸酶P1的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)改性樹脂：以表面修飾劑改性介孔樹脂，得到表面改性的介孔樹脂載體；其中，所述的表面改性劑為伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一種或幾種的混合物；所述的介孔樹脂為環氧基樹脂、氨基樹脂、磺酸基樹脂或者羧基化樹脂；(2)核酸酶P1固定化：將步驟(1)得到的介孔樹脂載體加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1與樹脂的質量比為10～250mg：1g，混合，在25℃振蕩反應時間2～12h，抽濾得到樹脂固定化核酸酶P1。2.根據權利要求1所述的固定化核酸酶P1的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，利用伴刀豆蛋白改性介孔樹脂的方法如下：(1a)伴刀豆蛋白活化：將伴刀豆蛋白溶于緩沖液中，所述的緩沖液包括如下組分：0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2、0.1mol/LKH2PO4、0.1mol/LK2HPO4、pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；(1b)戊二醛活化介孔樹脂：將50～200g介孔樹脂加入戊二醛溶液中，所述的戊二醛溶液為(w/w)2％的0...

【專利技術屬性】
技術研發人員：應漢杰，黃金莎，莊偉，吳菁嵐，周精衛，陳勇，陳曉春，朱晨杰，柳東，牛歡青，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32