一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法及應用，采用足月劑宮產健康胎兒臍帶經過無菌處理，機械剪切，經過膠原酶消化后分離培養而成，第3代左右，細胞形態變平坦，寬大，生長良好；本方法可將細胞培養至15代，細胞分裂相減少，細胞質疏松，可見空泡，細胞老化，增殖明顯變慢。因此，3代細胞具有較好活力，可用于后續研究或者治療。本發明專利技術制備得到的適用于人臍帶間充質干細胞，可以用于腦損傷治療，提高腦損傷后的功能恢復。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體地說，涉及一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法及應用。
技術介紹
人間充質干細胞(hUMSCs)是一個多能細胞群，可以從一些成人類型的組織輕松分離如骨髓、脂肪組織，也可從醫療廢物如臍帶和胎盤中分離。有報道從人臍帶中分離出MSCs，且細胞含量、增殖能力優于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，無倫理學爭議等優點，因此越來越受到研究工作者們的關注。這些具有分化成多種細胞的潛能(即成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌腱細胞和肌細胞，具有用于干細胞治療的前景。近年來,人臍帶間充質干細胞治療是再生醫學中再生和機體修復受損組織的的前沿目標。它是一種很有前途的治療技術，其中的移植的干細胞產生的組織覆蓋受損的組織，以達到修復和再生的原始組織的的能力。此外，正在調查他們的潛力來產生完整的器官為器官移植提供可靠路徑。這一迅速發展的治療領域，在治療無法治愈的疾病，如帕金森氏病，阿爾茨海默氏病，和糖尿病中有很大的前景。由于臍帶間充質干細胞這些優越的性能，它的增殖和分化的技術正在受到密切關注。腦損傷是臨床常見疾病死亡。死亡率和致殘率高，嚴重威脅生命和健康，給家庭和社會帶來很大的負擔，深入研究腦損傷的發病機制和尋找有效的治療方法是一個重要問題。然而，目前的措施有限，效果不佳，新的治療方案仍待發現。人間充質干細胞(hUMSCs)在治療神經疾病方面有其優勢，使用huMSCs移植技術，可通過干細胞多功能分化的特點來再生或者修復損傷組織，從而加快腦功能恢復，是一種未來可能用于臨床治療腦損傷的新策略。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術針對上述的問題，提供了一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法及應用。為了解決上述技術問題，本專利技術公開了一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：取足月剖腹產胎兒的臍帶，在無菌條件下剪取8-10cm，PBS沖洗，去除血跡，剪成1mm3的碎片，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化30min，取上清液800r/min離心5min，收集細胞沉淀，用DMEM-LG培養基稀釋后移入預先置有1.073g/mL的Percoll細胞分離液的離心管中，900r/min離心15min，吸取白膜層，洗滌2次，收集離心獲得的細胞，以2x106個/ml接種至含15％FBS的DMEM-LG培養基，在37℃、體積分數為5％的CO2培養箱中培養，3d后首次換液，去除未貼壁細胞，以后每3-4d換液一次，在相差硅微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，達到80％-90％融合時，用消化液培養傳代；第15代后，制備得到適用于人臍帶間充質干細胞。進一步地，傳代后潛伏期為24h，細胞倍增時間為38h。進一步地，消化液為2.5mg/mL胰酶和0.4mg/mLEDTA。本專利技術公開了一種上述的適用于人臍帶間充質干細胞在制備治療腦損傷藥物中的應用。與現有技術相比，本專利技術可以獲得包括以下技術效果：1)huMSCs接種48h內即貼壁；72h更換培養液時，可見少量CD45-FrrC散在分布的貼壁克隆，呈梭形，有胞漿突起，少數呈多角形；2周后均為成纖維細胞樣，胞漿豐富，核大，呈平行排列或旋渦狀生長，漩渦中心細胞多層分布。傳代后細胞生長迅速，約4d即可鋪滿全層，第3代細胞生長良好。第15代后，形態變平坦，寬大，分裂相減少，細胞質疏松，可見空泡，細胞老化，增殖明顯變慢。2)靜脈注射人臍帶間充質干細胞可以提高腦損傷后的功能恢復。當然，實施本專利技術的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，構成本專利技術的一部分，本專利技術的示意性實施例及其說明用于解釋本專利技術，并不構成對本專利技術的不當限定。在附圖中：圖1是本專利技術HUMSCs原代細胞(X400)；其中，A：培養3代3天；B：培養3代14天；C:培養15代14天；圖2是本專利技術HUMSCs表面標志的流式分析；圖3是本專利技術細胞生長曲線；圖4是本專利技術人臍帶間充質干細胞治療7天對大鼠腦損傷功能恢復的影響；圖5是本專利技術靜脈注射人臍帶間充質干細胞在大鼠腦損傷組織周存活情況。具體實施方式以下將配合實施例來詳細說明本專利技術的實施方式，藉此對本專利技術如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。實施例1適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法1.1材料足月剖腹產胎兒的臍帶來自本院(遵照醫院規定并經家屬同意獲取)；II型膠原酶(2000U/rag)、DMEM-LG培養基、HEPES購于Gibco公司；Percoll細胞分離液購自Pharmacia公司；胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產品；CD14、CD29、CD34、CD44、CD45單抗為BD公司產品；DMSO為Sigma公司產品，CO2培養箱為美國Heraeus公司產品；倒置相差顯微鏡為上海海鷗公司產品；96孔培養板為中國畢龍公司產品。1.2huMSCs的分離與體外培養：取足月剖腹產胎兒的臍帶，在無菌條件下剪取8-10cm，PBS沖洗，去除血跡，剪成碎片(1mm3左右)，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化30min，取上清液800r/min離心5min，收集細胞沉淀，用DMEM-LG培養基稀釋后移入預先置有Percoll細胞分離液(1.073g/mL)的離心管中，900r/min離心15min，吸取白膜層，洗滌2次，收集離心獲得的細胞，以2x106(個/ml)接種至含15％FBS的DMEM-LG培養基，在37℃、體積分數為5％的CO2培養箱中培養，3d后首次換液，去除未貼壁細胞，以后每3-4d換液一次，在相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，達到80％-90％融合時，用2.5mg/mL胰酶+0.4mg/mLEDTA消化培養傳代。1.3huMSCs形態觀察：觀察4天，三代14天，15代14天的培養細胞形態。1.4huMSCs表面標志的檢測：將接近融合的第4代huMSCs用胰酶消化，離心洗滌，制備成1x106個/ml細胞懸液，用單克降抗體標記細胞，FACScan流式細胞儀檢測其表面標志。1.5生長曲線細胞按2xl06(個/ml)接種于96孔培養板，用2.5mg/mL胰酶+0.4mg/ml，EDTA消化后，進行臺盼旋拒染色法計數活細胞，每天取12復孔，共7d；根據汁數結果繪制生長曲線。1.6細胞存活觀察，熒光顯微鏡下觀察移植細胞腦內存活情況2結果2.1huMSCs的生長情況：huMSCs接種48h內即貼壁；72h更換培養液時，可見少量CD45-FrrC散在分布的貼壁克隆，呈梭形，有胞漿突起，少數呈多角形；2周后均為成纖維細胞樣，胞漿豐富，核大，呈平行排列或旋渦狀生長，漩渦中心細胞多層分布。傳代后細胞生長迅速，約4d即可鋪滿全層，第15代后，形態變平坦，寬大，分裂相減少，細胞質疏松，可見空泡，細胞老化，增殖明顯變慢，見圖1。2.2huMSCs的表面標志：取第3代PMSCs進行表面標志檢測，結果表明，CDl4/CD34/CD45陰性，CD29/CD44陽性，均一性在98％左右。huMSCs是區別于造血細胞的一群處于未分化狀態的非定向前體細胞，見圖2。2.3細胞生長曲線：通過7d連續測定，如圖3所示，其生長曲線顯示，傳代后潛伏期約為24h，細胞倍增時本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：取足月剖腹產胎兒的臍帶，在無菌條件下剪取8?10cm，PBS沖洗，去除血跡，剪成1mm3的碎片，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化30min，取上清液800r/min離心5min，收集細胞沉淀，用DMEM?LG培養基稀釋后移入預先置有1.073g/mL的Percoll細胞分離液的離心管中，900r/min離心15min，吸取白膜層，洗滌2次，收集離心獲得的細胞，以2x106個/ml接種至含15％FBS的DMEM?LG培養基，在37℃、體積分數為5％的CO2培養箱中培養，3d后首次換液，去除未貼壁細胞，以后每3?4d換液一次，在相差硅微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，達到80％?90％融合時，用消化液培養傳代；第15代后，制備得到適用于人臍帶間充質干細胞。

【技術特征摘要】
1.一種適用于人臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：取足月剖腹產胎兒的臍帶，在無菌條件下剪取8-10cm，PBS沖洗，去除血跡，剪成1mm3的碎片，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化30min，取上清液800r/min離心5min，收集細胞沉淀，用DMEM-LG培養基稀釋后移入預先置有1.073g/mL的Percoll細胞分離液的離心管中，900r/min離心15min，吸取白膜層，洗滌2次，收集離心獲得的細胞，以2x106個/ml接種至含15％FBS的DMEM-LG培養基，在37℃、體積分數為5％的CO...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王廷華，
申請(專利權)人：昆明醫科大學，
類型：發明
國別省市：云南;53