一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，其步驟如下：一、提取總RNA；二、反轉(zhuǎn)錄為cDNA；三、對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)；四、將THCA合成酶基因正向片段與pSKint載體連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，酶切鑒定得到pSKTHCAihp?Ⅰ；五、pSKTHCAihp?Ⅰ與THCA合成酶基因反向片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，酶切鑒定得到pSKihpTHCA；六、含有正反向THCA合成酶基因和內(nèi)含子的片段與pCAMBIAsuper1300+植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定得到植物表達(dá)載體pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA。本發(fā)明專利技術(shù)填補(bǔ)大麻RNAi載體構(gòu)建方法的空白。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種大麻RNAi載體構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
大麻(CannabisSativaL.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis)一年生草本植物，由于大麻中含有一種致幻成癮的活性成分—四氫大麻酚(THC)，易被不法分子用來(lái)非法生產(chǎn)毒品，造成社會(huì)危害，許多國(guó)家把工業(yè)大麻也一并列為禁種作物。大麻中的THC含量是由大麻的基因(內(nèi)因)決定，并和生長(zhǎng)環(huán)境(溫度、濕度、土壤條件、日照等)(外因)有關(guān)。由于栽培小環(huán)境的不同，THC含量在個(gè)體之間存在差異；如將大麻種植于有足夠空間的內(nèi)陸環(huán)境時(shí)，其體內(nèi)THC含量顯著提高。早在1995年，人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了THC生物合成途徑中的關(guān)鍵酶是四氫大麻酸(THCA)合成酶，這個(gè)酶是一個(gè)分子量為74kDa的單體脫氫酶，它催化由戊基間苯二酚酸到四氫大麻酸A的氧化環(huán)化反應(yīng)。采用基因敲除突變(knock-outmutation)的方法使THC生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶失活，可為培育出不含THC的大麻新品系奠定基礎(chǔ)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)其指內(nèi)源或外源雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介導(dǎo)的內(nèi)源靶基因的mRNA發(fā)生特異性降解，進(jìn)而抑制基因的表達(dá)，使基因沉默的現(xiàn)象，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。目前已報(bào)道了亞麻、苧麻一些麻類(lèi)作物中的某些基因RNAi載體的構(gòu)建，但尚未有大麻RNAi載體構(gòu)建方法的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，以填補(bǔ)大麻RNAi載體構(gòu)建方法的空白。本專利技術(shù)的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：一、以大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣為材料，提取總RNA；二、反轉(zhuǎn)錄為cDNA；三、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，用高保真Taq酶對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物并回收；四、將經(jīng)SalⅠ/HindⅢ雙酶切的THCA合成酶基因正向片段與SalⅠ/HindⅢ雙酶切pSKint載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由SalⅠ/HindⅢ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKTHCAihpⅠ；五、pSKTHCAihpⅠ經(jīng)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切與經(jīng)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切的THCA合成酶基因反向片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由SalⅠ/SacⅠ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKihpTHCA；六、膠回收獲得含有正反向THCA合成酶基因和內(nèi)含子的片段，與經(jīng)SalⅠ/SacⅠ雙酶切pCAMBIAsuper1300+植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定，SalⅠ/SacⅠ雙酶切進(jìn)一步鑒定，植物表達(dá)載體pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA構(gòu)建成功。本專利技術(shù)構(gòu)建THCA合成酶基因RNAi載體的基因，提取自大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣中，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本專利技術(shù)構(gòu)建的THCA合成酶基因RNAi載體可為培育出不含四氫大麻酚(THC)的大麻新品系奠定基礎(chǔ)，創(chuàng)造更多的優(yōu)異新種質(zhì)，服務(wù)于工業(yè)大麻育種和理論研究。附圖說(shuō)明圖1為將THCA正反向基因克隆到中間載體pSKint的內(nèi)含子兩端，構(gòu)建pSKintihpTHCA，酶切位點(diǎn)為SalⅠ，HindⅢ，BamHⅠ，SacⅠ；圖2為植物表達(dá)載體pCAMBIASuper1300+，其是經(jīng)pCAMBIA1300改造而來(lái)，將pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)整個(gè)切下來(lái)，加入superpromoter和多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)依次為XbaⅠ,HindⅢ,PstⅠ,ApaⅠ,SmaⅠ,SalⅠ,SwaⅠ,SpeⅠ,KpnⅠ,SacⅠ；圖3為RNAi載體pCAMBIASuper1300+ihpTHCA的構(gòu)建流程圖；圖4為大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣總RNA提取的圖片；圖5為CsTHCAihpⅠ和ihpⅡPCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖，堿基數(shù)為504bp；圖6為pSKTHCAihpⅠ質(zhì)粒圖，1泳道為pSKint質(zhì)粒；圖7為pSKihpTHCA質(zhì)粒SalⅠ/SacⅠ酶切鑒定圖，intron(163bp)+正反向基因序列約為1171bp；圖8為RNAi載體pCAMBIASuper1300+ihpTHCA質(zhì)粒SalⅠ/SacⅠ酶切鑒定圖；圖9為pCAMBIASuper1300+ihpTHCARNAi載體農(nóng)桿菌凍融法轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒PCR鑒定圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本專利技術(shù)技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本專利技術(shù)技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍中。本專利技術(shù)提供了一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，具體構(gòu)建步驟如下：一、以大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣為材料，利用TRIzol提取液抽提RNA，具體步驟如下：(1)取植物材料約0.1g在液氮中研磨至細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5mL離心管；加入1mLTRIzol提取液震蕩搖勻；(2)混勻后置于冰上5min，4℃，12000rpm離心15min；取上清液，順序加入100μL3MNaOAC(pH5.2)，混勻，200μL的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，充分混勻。置于冰上靜置10min；(3)4℃，12000rpm離心15min；加入0.5mL異丙醇在-20℃條件下，沉淀20min以上；(4)然后在2～8℃條件下，12000rpm離心20min，RNA沉淀管壁和底部；(5)去掉液體部分，加入1mL75％乙醇；在2～8℃條件下，12000rpm離心10min；(6)去掉液體部分，風(fēng)干后，加入30μLDNase/RNase-free去離子水溶解RNA，儲(chǔ)藏于-80℃冰箱備用，得到大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣總RNA(圖4)。注：要戴口罩和手套，且要常換手套。二、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中：cDNA第一鏈合成中各組分如下：反應(yīng)條件：50℃，45min；85℃，5min，cDNA產(chǎn)物在-20℃儲(chǔ)存，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。三、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，用高保真Taq酶對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物并回收，其中：(1)引物序列如下：正向序列：酶切位點(diǎn)SalⅠ和HindⅢTHCAihpⅠSalF：5’-CTAGTCGACCTCAGCATTTTCCTTTTG-3’；THCAihpⅠHinR：5’-GCCCCAAGCTTAAACTAAGATTCTCATTC-3’；基因大小：504bp。反向序列：酶切位點(diǎn)SacⅠ和BamHⅠTHCAihpⅡSacF：5’-GTAGAGCTCCTCAGCATTTTCCTTTTG-3’；THCAihpⅡBamR：5’-GGCGGATCCAAACTAAGATTCTCATTC-3’；基因大小：504bp。(2)PCR反應(yīng)中各組分如下：反應(yīng)條件如下：CsTHCAihpⅠ和ihpⅡPCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖5所示。四、如圖1所示，將經(jīng)SalⅠ/HindⅢ雙酶切的THCA合成酶基因正向片段與SalⅠ/HindⅢ雙酶切pSKint本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法步驟如下：一、以大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣為材料，提取總RNA；二、反轉(zhuǎn)錄為cDNA；三、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，用Taq酶對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物并回收；四、將經(jīng)Sal?Ⅰ/Hind?Ⅲ雙酶切的THCA合成酶基因正向片段與Sal?Ⅰ/Hind?Ⅲ雙酶切pSKint載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由Sal?Ⅰ/Hind?Ⅲ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKTHCAihp?Ⅰ；五、pSKTHCAihp?Ⅰ經(jīng)BamH?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切與經(jīng)BamH?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切的THCA合成酶基因反向片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由Sal?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKihpTHCA；六、膠回收獲得含有正反向THCA合成酶基因和內(nèi)含子的片段，與經(jīng)Sal?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切pCAMBIAsuper1300+植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定，Sal?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切進(jìn)一步鑒定，植物表達(dá)載體pCAMBIAsuper1300+ihpTHCA構(gòu)建成功。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種大麻T(mén)HCA合成酶基因RNAi載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述構(gòu)建方法步驟如下：一、以大麻花期葉片、雄花、雌花混合樣為材料，提取總RNA；二、反轉(zhuǎn)錄為cDNA；三、以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，用Taq酶對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物并回收；四、將經(jīng)SalⅠ/HindⅢ雙酶切的THCA合成酶基因正向片段與SalⅠ/HindⅢ雙酶切pSKint載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由SalⅠ/HindⅢ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKTHCAihpⅠ；五、pSKTHCAihpⅠ經(jīng)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切與經(jīng)BamHⅠ/SacⅠ雙酶切的THCA合成酶基因反向片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，提取菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，由SalⅠ/SacⅠ雙酶切進(jìn)一步鑒定得到pSKihpTHCA；六、膠回收獲得含有正反向THCA合成酶基因和內(nèi)含子的片段，與經(jīng)SalⅠ/SacⅠ雙酶切pCAMBIAsuper1300+植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姜穎，孫宇峰，李秋芝，赫大新，潘冬梅，夏尊民，王曉楠，韓承偉，韓喜財(cái)，曹焜，魏國(guó)江，王曉飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：黑龍江省科學(xué)院大慶分院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：黑龍江;23