活動性結核病診斷分子的篩選與應用制造技術

本發明專利技術提供了活動性結核病診斷分子的篩選與應用。具體地，本發明專利技術公開了結核分枝桿菌重要抗原的高通量篩選及其在活動性結核病診斷中的應用。本發明專利技術人基于GST融合表達的高通量功能蛋白篩選技術，篩選到92個能被結核病病人血清識別的陽性抗原，其中14個抗原呈現強陽性反應。活動性結核血清學檢測表明，用這些陽性抗原檢測活動性結核病具有較高的敏感性和特異性。將其中的TBGP1、TBGP2、TBGP3、TBGP4、TBGP5和TBGP6這6個蛋白組成的抗原組合，用作結核病血清學檢測，經實驗室驗證表明，該組合檢測結核分枝桿菌具有較高敏感性和特異性，在結核病診斷和監測中具有應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體地，本專利技術涉及活動性結核病診斷分子的篩選與應用。
技術介紹
結核病(Tuberculosis)是由結核分枝桿菌復合群(MycobacteriumTuberculosisComplex)感染引起的、以呼吸系統感染為主的傳染性疾病。由于卡介苗(BCG)的專利技術和有效治療結核病藥物的廣泛使用，結核病一度得到有效控制。自上個世紀90年代以來，由于全球化帶來的人口大規模流動、抗生素的濫用，加之人們對結核病防范意識的松懈，結核病死灰復燃，卷土重來，成為嚴重威脅人類健康的重要傳染性疾病。WHO等國際組織在本世紀初制定了以遏制結核病流行的千年發展目標計劃，雖然一定程度上減少了結核病的新發病率和死亡率，但成效并不顯著，結核病沒有完全得到消除，全球結核病的防控形勢依然嚴峻。據估計，全球有近1/3人口感染結核分枝桿菌，約有2000萬結核病人，每年有860萬新發病例，至少130萬人死于該病。目前全球結核病負擔最重的國家主要集中在亞洲和非洲，我國在22個結核病高負擔國家中結核患者人數居世界第二。事實上，由于耐多藥結核菌株、廣泛耐藥結核菌株等的出現，HIV/AIDS在結核病流行區域的傳播，以及傳統結核病疫苗卡介苗(BCG)的免疫保護作用降低，結核問題變得更加復雜。缺少有效的結核感染診斷方法是結核病難以根除的一個重要原因。傳統的結核病診斷方法有很多不足，痰涂片鏡檢檢出率低，痰結核菌培養費時費力，影像學檢查作為輔助手段無法精確識別微小病灶等。近年來發展的結核診斷技術有PCR擴增技術、快速痰培養、以及新型影像學等，但是這些技術在發展中國家受到費用限制，并且不適合大規模監視和篩查。TST是應用最廣的結核感染檢測手段，但是其敏感性低，且易受卡介苗(BCG)接種影響，與其他分枝桿菌存在交叉感染等。IGRAs通過檢測機體內結核分枝桿菌特異性抗原刺激后引起的γ干擾素釋放診斷結核感染情況。與TST相比，IGRAs由于使用RD(regionofdifference)區缺失基因編碼的抗原，如CFP-10，ESAT-6和TB7.7等，在卡介苗廣泛接種地區具有較高的特異性，但是其敏感性仍有待提高，特別是在免疫抑制人群中會出現較多無法判定的結果。此外，TST和IGRAs兩者均不能區分活動性結核和潛伏性結核，這使得其在結核病高流行地區的臨床應用中受到極大地限制。因此，本領域迫切需要開發更準確有效的結核感染診斷方法和工具。
技術實現思路
本專利技術的目的就是提供準確有效的結核感染診斷方法和工具。在本專利技術的第一方面，提供了一種結核陽性抗原組合(或抗原集)，所述的抗原組合包括n種活動性結核抗原，其中，n為5-100的正整數，并且所述的活動性結核抗原選自下組：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽與GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10個(較佳地3-7個)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意組合。在另一優選例中，n為6-50，更佳地n為6-20。在另一優選例中，所述的抗原組合包括選自下組的活動性結核抗原：(a1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽；(b1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽與GST的融合蛋白；(c1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽與其他不同的活動性結核抗原融合形成的融合多肽。在另一優選例中，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：1、2、3、4、5和6所示的6種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。在另一優選例中，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：1-14所示的14種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。在另一優選例中，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：5、6、8、9、10、11、12和14所示的1、2、3、4、5、6、7或8種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。在另一優選例中，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：1和2所示的2種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。在另一優選例中，所述抗原組合的活動性結核的檢測準確性≥60％(更佳地≥60％)且靈敏度≥85％(更佳地≥88％)。本專利技術還提供了一種活動性結核抗原，選自下組：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽與GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10個(較佳地3-7個)多肽融合形成的融合多肽。在本專利技術的第二方面，提供了第一方面所述陽性抗原或結核陽性抗原組合的用途，用于制備檢測活動性結核的試劑或試劑盒。在另一優選例中，所述的試劑包括血清檢測試劑、檢測板、或芯片。在本專利技術的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自下組：(a)編碼第一方面所述陽性抗原或抗原組合的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸.在另一優選例中，所述的多核苷酸為編碼SEQIDNO:1-14任一所示的(較佳地編碼SEQIDNO:1-6所示)氨基酸序列的多核苷酸。在另一優選例中，所述的多核苷酸為編碼SEQIDNO:5、6和8中任一所示的氨基酸序列的多核苷酸。在本專利技術的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有第三方面所述的多核苷酸。在本專利技術的第五方面，提供了一種宿主細胞，它含有第四方面所述的載體，或其染色體整合有第三方面所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述的宿主細胞是大腸桿菌。在本專利技術的第六方面，提供了一種制備結核分枝桿菌陽性抗原的方法，包括步驟：(a)在適合表達的條件下，培養第五方面所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出所述的結核分枝桿菌陽性抗原。在另一優選例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:1-14任一所示；較佳地，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:1-6所示。在另一優選例中，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:5、6和8中任一所示。在本專利技術的第七方面，提供一種用于檢測活動性結核的試劑盒，所述試劑盒包括：容器或載體；以及位于所述容器內或載體上的本專利技術第一方面所述的陽性抗原組合。在另一優選例中，所述的陽性抗原組合中各活動性結核抗原分別位于不同的容器內、或者分別位于不同的載體上，或者分別位于載體的不同檢測區(或檢測點)。在另一優選例中，所述試劑盒還包括酶結合液、反應底物和任選的說明書；較佳地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。在另一優選例中，所述的固相載體上包被有氨基酸序列如SEQIDNO：1-6所示的陽性抗原，以及任選的選自氨基酸序列如SEQIDNO：7-92所示的一種或多種陽性抗原(尤其是SEQIDNO.:8所示的陽性抗原)。在另一優選例中，所述的試劑盒或試劑用于檢測待測樣本是否感染結核分枝桿菌。在另一優選例中，所述待測樣本來自結核分枝桿菌流行區人群。在本專利技術的第八方面，提供一種檢測活動性結核的試劑，所述試劑包括：固相載體以及包被于所述固相載體上的本專利技術第一方面所述的陽性抗原組合。在另一優選例中，所述的試劑為蛋白芯片。在另一優選例中，所述的蛋白芯片用于檢測血液樣品或血清樣品。在另一優選例中，所述陽性抗原組合中各活動性結核抗原分別位于不同的載體上，或者分別位于本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種結核陽性抗原組合(或抗原集)，其特征在于，所述的抗原組合包括n種活動性結核抗原，其中，n為5?100的正整數，并且所述的活動性結核抗原選自下組：(a)序列如SEQ?ID?NO.:1?92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQ?ID?NO.:1?92中任一所示的多肽與GST的融合蛋白；(c)由(a)中2?10個(較佳地3?7個)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意組合。

【技術特征摘要】
1.一種結核陽性抗原組合(或抗原集)，其特征在于，所述的抗原組合包括n種活動性結核抗原，其中，n為5-100的正整數，并且所述的活動性結核抗原選自下組：(a)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽；(b)序列如SEQIDNO.:1-92中任一所示的多肽與GST的融合蛋白；(c)由(a)中2-10個(較佳地3-7個)多肽融合形成的融合多肽；(d)上述(a)、(b)和(c)的任意組合。2.如權利要求1所述的抗原組合，其特征在于，所述的抗原組合包括選自下組的活動性結核抗原：(a1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽；(b1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽與GST的融合蛋白；(c1)序列如SEQIDNO.:5、6或8所示的多肽與其他不同的活動性結核抗原融合形成的融合多肽。3.如權利要求1所述的抗原組合，其特征在于，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：1、2、3、4、5和6所示的6種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。4.如權利要求1所述的抗原組合，其特征在于，所述抗原組合包括氨基酸序列分別如SEQIDNO：1-14所示的14種多肽或其相應的融合蛋白或融合多肽。5.一種如權利要求1所述的結核陽性抗原組合的用途，其特征在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘衛慶，徐新東，周方斌，
申請(專利權)人：同濟大學，
類型：發明
國別省市：上海;31