一種氧化酶及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種來源于雷氏普羅威登斯菌(Providencia?rettgeri)的L?α?羥酸氧化酶基因的獲得及其克隆表達，屬于生物工程領域。公開了其底物特異性，同時該L?α?羥酸氧化酶可以氧化(S)?α?羥酸酯，可應用于光學純(R)?α?羥酸酯的制備。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術克隆表達了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。
技術介紹
L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacidoxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphaticl-α-hydroxyacidoxidasefromratliverspurificationandproperties.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Enzymology1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolateoxidase)(Preparationandsomepropertiesofcrystallineglycolicacidoxidaseofspinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactateoxidase)(ConversionofL-lactateoxidasetoalongchainalpha-hydroxyacidoxidasebysite-directedmutagenesisofalanine95toglycine.JBiolChem.19968；271(45):28300-28305)。可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)目前為止，已經在惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，綠色氣球菌(Aerococcusviridians)，鏈球菌屬(Streptococcussp.)，片球菌屬(Pediococcussp.)，乳酸乳球菌(Lactococuslactis)，遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis),運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)和過氧化醋桿菌(Acetobacterperoxidans)等細菌中克隆表達得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測到，例如白地霉(Geotrichumcandidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。(SearchforLactateOxidaseProducerMicroorganisms，AppliedBiochemistryandMicrobiology,2007,43(2)178–181)本專利技術首次從KerstersiagyiorumDSM16618中克隆表達出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應用于光學純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。
技術實現思路
本專利技術從雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。本專利技術的技術方案如下：1、菌株本專利技術L-α-羥酸氧化酶基因的來源菌株為：ProvidenciarettgeriATCC29944，購自美國ATCC菌種庫。2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆提取ProvidenciarettgeriATCC29944菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出L-α-羥酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。3、L-α-羥酸氧化酶表達與純化將重組質粒導入E.coliBL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。4、L-α-羥酸氧化酶的酶學性質分析以L-乳酸為底物研究pH對本專利技術所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。以L-乳酸為底物研究溫度對本專利技術所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。L-α-羥酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、L-對羥基苯乳酸、L-丹參素、L-扁桃酸。酶活測定方法為：根據CharacterizationofaLactateOxidasefromaStrainofGramNegativeBacteriumfromSoil，AppliedBiochemistryandBiotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。5、L-α-羥酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxyesters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉化16h，轉化后液相色譜分析上清液。(S)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(R)-α-羥酸酯不被氧化。產物(R)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：對映體過量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)]×100％(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％式中SR為反應后(R)-對映體的峰面積，SS為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S0為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。產物測定液相色譜條件為：ChiralcelOD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。所述的α-羥酸酯，根據中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。本發表明的有益之處：從ProvidenciarettgeriATCC29944中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶，該酶可以氧化(S)-α-羥酸和(S)-α-羥酸酯，可用于規模化制備手性純(R)-α-羥酸酯，具有重要的工業應用價值。具體實施方式實施例1本實施例為本專利技術所述L-α-羥酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。1、ProvidenciarettgeriATCC29944DNA的提取將ProvidenciarettgeriATCC29944菌株在LB培養基中培養12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。2、大腸桿菌感受態制備(1)接種E.coliDH5α和BL21(DE3)分別于含有20mLLB培養基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養過夜。(2)按1％接種量接種于50mLLB培養基中，37℃培養至OD600約0.6(約2～3h)。(3)將菌液轉移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種來源于雷氏普羅威登斯菌(Providencia?rettgeri)的L?α?羥酸氧化酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2所示。

【技術特征摘要】
1.一種來源于雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)的L-α-羥酸氧化酶，其氨基酸序列為SEQIDNO:2所示。2.根據權利要求1所述的L-α-羥酸氧化酶，其核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。3.根據權利要求1所述的L-α-羥酸氧化酶，其最適反應溫度為40℃，最適反應pH為4。4.根據權利要求1所述的L-α-羥酸氧化酶，可氧化L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-對羥基苯乳酸、L-酒石酸、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡宇杰，沈天成，馮佳婷，白亞軍，鄭曉暉，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32