本發明專利技術公開了一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，特點是具體步驟如下：（1）基于載體輔助液液萃取技術通過一次性前處理，完成涵蓋了理化性質差異很大的常見8大類，共計99種獸藥殘留的提取、凈化工作；（2）混合標準溶液組成和基質標準曲線制備；（3）利用超高效液相色譜?三重四極桿串聯質譜聯用測定待測樣品中99種獸藥殘留的濃度；優點是該方法的前處理和儀器分析過程針對不同理化性質的化合物兼容性強，檢測效率高，可操作性強，檢測限能滿足所有受試的目標物并且降低了檢測成本。
High throughput detection method for 99 Kinds of veterinary drug residues in animal source food
The invention discloses a 99 Kinds of veterinary drug residues in animal derived food high-throughput detection method is as follows: (1) based on carrier assisted liquid-liquid extraction technology by one-time pretreatment, covering the complete difference of physicochemical properties very common in 8 categories, a total of 99 Kinds of extraction and purification of veterinary drug residues work; (2) the matrix composition and the standard curve of mixed standard solution preparation; (3) using ultra performance liquid chromatography tandem three determination of 99 Kinds of veterinary drug residues concentration in the sample with tandem mass spectrometry; analysis of pretreatment and instrument has the advantages of the method according to the different physicochemical properties of compound compatibility the strong, high detection efficiency, strong operability, the detection limit can meet the target of all subjects and reduce the test cost.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種獸藥殘留檢測方法，尤其是涉及一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法。
技術介紹
獸藥的種類很多，殘留毒理學意義較大的獸藥按其用途可以分類主要包括：抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲類、生長促進劑和殺蟲劑等。根據聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）獸藥殘留聯合立法委員會的定義，獸藥殘留（veterinarydrugresidues）是指動物產品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關的雜質。[1]由于獸藥殘留的對人體的危害極大，因此動物源性食品中的獸藥殘留是世界各國食品安全檢測的重要指標，我國政府也制定了一系列法律法規和技術標準限制獸藥殘留的超標。然而，綜觀近年來中國畜牧業的發展，由于養殖條件的差異和利益驅使等因素的影響，獸藥殘留超標現象時有發生。據報道，我國每年食品中毒人數高達2萬～4萬人，而專家估計這個數字尚不到實際發生數的1/10。2009年，廣州市民食用含“瘦肉精”豬肝70多人食物中毒。劉軍等對135份鮮牛乳中的四環素類抗生素殘留進行了檢測，金霉素、土霉素、四環素殘留的檢出率分別為8％、18％、14％；張莉等對哈爾濱市市售雞肉、雞肝中的土霉素殘留進行了檢測，陽性率分別為64％，80％。另外，動物源性食品中激素類藥物殘留的情況也非常普遍，郭子俠等對北京市售的動物鞭、胎盤、蛇、甲魚等動物原料生產的保健食品進行了檢測，檢出率分別為32.6％，47.8％，32.6％和15.2％；還對牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、雞蛋、魚、牛奶等七類動物性食品中的雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、睪酮類5種性激素進行了調查，結果顯示7類上述食品的激素檢出率均超過20%。2012年，肯德基供應商-六和集團被曝光對原料雞養殖過程中所用抗生素種類達18種，其中很多抗生素停藥期不停用；此外還有一些養雞場在使用國家禁用的地塞米松激素類藥物。這些事件的屢有發生對獸藥殘留檢測技術提出了更高的要求。目前，我國可以用于獸藥殘留檢測的國家標準多達數十個，但大多是按照獸藥類別建立的僅僅適用于某一種動物源性食品中某一類獸藥殘留的分析方法。這些方法的樣品前處理過程各異，耗時較長，檢測項目覆蓋范圍小，無法滿足多殘留篩查的需求。因此，研究建立動物源性食品中多種類獸藥殘留高通量篩查技術對于有效提高監管工作效率，保障我國人民的食品安全具有非常重要的意義。獸藥殘留分析方法包括了樣品前處理技術和儀器分析技術。由于獸藥殘留水平很低，樣品基質復雜、干擾物質多，不易進行分離、純化，因此樣品前處理是整個獸藥殘留分析檢測過程中耗時最長、勞動強度最大、同時也是產生誤差最多的一個環節。常見的獸藥殘留樣品前處理技術有固相萃取、固相微萃取、基質分散固相萃取、免疫親和色譜技術、分子印跡技術、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等，這些前處理方法在獸藥殘留分析中的應用各有其特點,但都存在有選擇性限制的缺點，樣品處理通量也不夠高。為了能夠同時分析檢測不同物理和化學性質的多種獸藥殘留，需要發展非選擇性的高通量樣品制備方法。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法因其具有快速、簡單、便宜、有效、耐用和安全可靠等特點而得名，在農藥多殘留檢測中得到了廣泛的應用。隨著應用推廣的不斷展開，QuEChERS法在獸藥殘留檢測方面的應用也日趨增多。牛乳、雞蛋、肝臟、肌肉組織中的磺胺類、喹諾酮類、苯并咪唑類、阿維菌素類等獸藥殘留的QuEChERS檢測方法均有報道。盡管目前QuEChERS法在獸藥殘留高通量分析檢測方面已經有了較多的應用，但已有的研究表明應用QuEChERS方法在測定例如青霉素類、四環素類、喹諾酮類等極性較強的獸藥時，存在著回收率低，無法滿足殘留分析要求的不足。載體輔助液液萃取（SupportedLiquid-LiquidExtraction，SLLE）是一項重要的樣品前處理技術，它以硅藻土等為固體載體，保留吸附含水提取溶液中的待測化合物，再以與其不相容的有機溶劑洗脫達到樣品提取、凈化、濃縮的目的，在農藥殘留、藥物分析等領域有著廣泛的應用。與傳統液液萃取相比，SLLE無需借助分液漏斗及大量有機溶劑多次提取待測組分，操作步驟簡單、溶劑用量小、不易發生乳化、重現性好等優點。儀器分析技術隨著質譜的發展和推廣，一次分析檢測完成多個或多類殘留已成為可能。近年來，動物源食品中獸藥殘留正逐漸由用液相色譜-三重四級桿質譜（LC-MS/MS）進行目標型檢測向用高分辨質譜（HRMS）進行精確質量非目標型全掃描檢測轉變。傳統的LC-MS/MS在定量分析上有一定的優勢，但也存在不足，如：只有質譜方法中涵蓋的化合物才可被檢測到，分析化合物數量有限，需要對每種化合物進行參數優化，比較耗時，對基質的干擾比較敏感，相關的樣品制備方法較為復雜；分辨率低，不能有效區分分子量相近的化合物，會造成假陽性結果等。與LC-MS/MS相比，HRMS主要依靠精確質量數（可精確到小數點第4位）和保留時間來對待測物進行定性識別。靜電場軌道阱高分辨質譜（OrbitrapMS）是近年來新興的一種傅里葉轉換高分辨質譜，其參數設定簡單，基于真實高分辨能力的高準確度，真實的同位素峰型分布測定能力，其精確質量數可以給出元素組成，從而提供待測物結構信息，能夠更徹底地排除基質干擾，將質量數非常相近的樣品背景基質干擾物質和待測物區分開，大大降低了分析檢測中對色譜分離的要求。OrbitrapMS可通過全掃描進行非定向和未知化合物的篩選，需要增加目標化合物時，不必再次處理樣品和進樣，重新分析已有的全掃描數據即可；還可進行多級掃描，通過再打碎得到MS/MS譜圖進行譜庫檢索或者與標準物質比對來確證待測物。劉鑫等利用QuadrupoleOrbitrapMS同時檢測了雞肉中喹諾酮類、磺胺類、β-受體激動劑類等81種獸藥殘留，試樣經乙腈超聲提取，濃縮后用體積分數50%乙腈溶液定容后上機測定。試驗結果表明：各組分線性關系良好，線性回歸系數均在0.98以上。取10ng/mL基質加標液，重復進樣5次，各組分重復性良好，RSD均在15%以內。實際樣品中待測組分的結果確認借助通過標準物質建立的二級質譜庫檢索比對來完成。Hurtaud-Pessel等通過兩步萃取，利用LTQ-Orbitrap-MS全掃描方式篩查了肉類樣品中青霉素、先鋒霉素、磺胺類等多種獸藥的殘留情況。盡管已有一些學者開始研究動物源性食品中多種獸藥殘留的分析方法，但這些方法樣品前處理過程往往僅適用于某一些動物源性食品，檢測的項目也僅僅局限于某一類或幾類獸藥的殘留，還不能完全滿足動物源性食品中多種類獸藥殘留的監控要求。因此，亟需建立一種能完全滿足動物源性食品中多種類獸藥殘留檢測的方法。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，該方法的前處理和儀器分析過程針對不同理化性質的化合物兼容性強，檢測效率高，可操作性強，檢測限能滿足所有受試的目標物并且降低了檢測成本。本專利技術解決上述技術問題所采用的技術方案為：1、一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，具體步驟如下：（1）樣品前處理稱取液體樣品5.00g或者濃度為1g/mL的固體水溶液5mL于50mL離心管本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，其特征在于具體步驟如下：（1）樣品前處理稱取液體樣品5.00?g或者濃度為1?g?/mL的固體水溶液5mL于50?mL離心管中，加入5?mL?提取液，10?mL乙腈，斡旋充分混勻，以4500?r/min離心5?min，上清液轉移至另一50?mL離心管中，再在上清液中加入1g硫酸銨，充分混勻后離心5?min，得到上層乙腈相和下層水相，取下層水相過硅藻土柱，下接50ml離心管，并加入0.5ml二甲基亞砜得到上樣液；將上樣液上硅藻土柱后平衡15分鐘，然后將上層乙腈相過硅藻土柱進行洗脫，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗離心管中殘余的上樣液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脫液用純乙腈定容至25ml；將定溶液均分為2份，分別置于15ml具刻度離心管中，在微弱的氮氣流下吹干至1ml，用純水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml離心管中，于?4℃，15000?r/min下離心10?min，然后取400μL?上清液置于帶襯管的進樣瓶中進樣分析；同時做試劑空白樣品；（2）混合標準溶液組成和基質標準曲線制備A．混合標準溶液組成：磺胺類包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲異嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺對甲氧嘧啶，磺胺喹惡啉，磺胺二甲惡唑，磺胺二甲異惡唑，磺胺甲惡唑，磺胺噻唑，磺胺氯噠嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧芐胺嘧啶和磺胺胍，各成分濃度均為1.0ug/mL；喹諾酮類包括乙胺嘧啶,?環丙沙星,?恩諾沙星,?氧氟沙星,?諾氟沙星,?沙拉沙星,?培氟沙星,?奈啶酸,?奧索利酸,?氟甲奎,?吡哌酸,?西諾沙星,?麻保沙星,?司帕沙星,?雙氟沙星,?單諾沙星,?奧比沙星,?洛美沙星和依諾沙星，各成分濃度均為1.0ug/mL；激素類包括可的松，潑尼松，甲基潑尼松龍，炔諾酮，炔雌醇，醋酸美侖孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羥孕酮，雌酮，氫化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睪酮，潑尼松龍，雌二醇，己烯雌酚，甲睪酮，表睪酮，丙酸睪酮，苯甲酸雌二醇，追寶龍，諾龍，甲孕酮，17α?羥基孕酮和勃地酮(去氫睪酮)），各成分濃度均為0.1?ug/mL；紅霉素類包括紅霉素，替米考星，竹桃霉素，泰樂霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分濃度均為0.1?ug/mL；孔雀石綠類包括孔雀石綠，隱色孔雀石綠，結晶紫和隱色結晶紫，各成分濃度均為0.1ug/mL；青霉素類包括氨芐青霉素，乙氧萘青霉素，鄰氯青霉素，頭孢氨芐，雙氯青霉素，青霉素G和阿莫西林，各成分濃度均為1.0ug/mL；四環素類包括土霉素，強力霉素，金霉素和四環素，各成分濃度均為1.0ug/mL；氨苯砜類包括金剛乙胺，苯乙醇胺?A，N?乙酰氨苯砜，氨苯砜，金剛烷胺，吡喹酮和氯丙嗪，各成分濃度均為0.1ug/mL；B．基質標準曲線定量：在空白樣品中分別加入上述8種混合標準溶液0?μL，10?μL，20?μL，40?μL，100?μL，以濃度為橫坐標，儀器響應值（響應值=標準品峰面積/標準品質量）為縱坐標，做基質加標標準曲線，作為試樣處理液中待測物濃度定量的依據；（3）超高效液相色譜?三重四極桿串聯質譜聯用測定A．高效液相分離色譜柱：Hypersile?Gold?C18色譜柱，若測定激素成分則采用的型號為100mm?x?2.1mm,?1.9μm，若測定混合標準溶液中的其余成分則采用的型號為100mm?x?2.1mm,?3μm；若測定激素成分，則流動相A：含有0.1wt%氨水的甲醇溶液；流動相B：含有0.1wt%氨水的水?甲醇溶液，其中水與甲醇的體積比為95:5；若測定混合標準溶液中的其余成分則：流動相A：含有0.1wt%甲酸以及5mM乙酸銨的乙腈?水溶液，其中乙腈與水的體積比為95:5；流動相B：含有0.1wt%甲酸以及5mM乙酸銨的水?乙腈溶液，其中水與乙腈的體積比為95:5；流速：0.3?mL/min；進樣量：10?mL；若測定激素成分HPLC洗脫程序如下：；若測定混合標準溶液中的其余成分則HPLC洗脫程序如下：；B．質譜檢測離子源：HESI?II；噴霧電壓：若測定激素成分則采用正離子模式3800V/負離子模式2700V；若測定混合標準溶液中的其余成分則采用正離子模式3800V?；氣化溫度：350℃；鞘氣壓：N2，35?arb；輔助氣壓：N2，10?arb；，離子傳輸管管溫度：300℃；質量范圍：m/z?100?1000?(R?70000)；（4）濃度計算方法樣品中待測物的含量根據如下計算公式（1）得到：X=2*C*V/m，式中：X－?試樣中待測物含量，單位為μg/kg；C－?試樣處理液中待測物濃度，根據基質標準曲線計算得到，單位為μg/LV—?定容體...
【技術特征摘要】
1.一種動物源食品中99種獸藥殘留的高通量檢測方法，其特征在于具體步驟如下：（1）樣品前處理稱取液體樣品5.00g或者濃度為1g/mL的固體水溶液5mL于50mL離心管中，加入5mL提取液，10mL乙腈，斡旋充分混勻，以4500r/min離心5min，上清液轉移至另一50mL離心管中，再在上清液中加入1g硫酸銨，充分混勻后離心5min，得到上層乙腈相和下層水相，取下層水相過硅藻土柱，下接50ml離心管，并加入0.5ml二甲基亞砜得到上樣液；將上樣液上硅藻土柱后平衡15分鐘，然后將上層乙腈相過硅藻土柱進行洗脫，再依次用10ml，10ml，6ml乙腈清洗離心管中殘余的上樣液后，清洗液上硅藻土柱后，洗脫液用純乙腈定容至25ml；將定溶液均分為2份，分別置于15ml具刻度離心管中，在微弱的氮氣流下吹干至1ml，用純水定容至2ml，取出1ml置于1.5ml離心管中，于-4℃，15000r/min下離心10min，然后取400μL上清液置于帶襯管的進樣瓶中進樣分析；同時做試劑空白樣品；（2）混合標準溶液組成和基質標準曲線制備A．混合標準溶液組成：磺胺類包括磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺二甲異嘧啶，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺多辛，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺對甲氧嘧啶，磺胺喹惡啉，磺胺二甲惡唑，磺胺二甲異惡唑，磺胺甲惡唑，磺胺噻唑，磺胺氯噠嗪，磺胺甲噻二唑，磺胺苯甲酰，磺胺苯吡唑，三甲氧芐胺嘧啶和磺胺胍，各成分濃度均為1.0ug/mL；喹諾酮類包括乙胺嘧啶,環丙沙星,恩諾沙星,氧氟沙星,諾氟沙星,沙拉沙星,培氟沙星,奈啶酸,奧索利酸,氟甲奎,吡哌酸,西諾沙星,麻保沙星,司帕沙星,雙氟沙星,單諾沙星,奧比沙星,洛美沙星和依諾沙星，各成分濃度均為1.0ug/mL；激素類包括可的松，潑尼松，甲基潑尼松龍，炔諾酮，炔雌醇，醋酸美侖孕酮，己烷雌酚，己二烯雌酚，醋酸甲羥孕酮，雌酮，氫化可的松，孕酮，雌三醇，地塞米松，醋酸甲地孕酮，睪酮，潑尼松龍，雌二醇，己烯雌酚，甲睪酮，表睪酮，丙酸睪酮，苯甲酸雌二醇，追寶龍，諾龍，甲孕酮，17α-羥基孕酮和勃地酮(去氫睪酮)），各成分濃度均為0.1ug/mL；紅霉素類包括紅霉素，替米考星，竹桃霉素，泰樂霉素，克林霉素，螺旋霉素，吉他霉素，交沙霉素，林可霉素和泰妙菌素，各成分濃度均為0.1ug/mL；孔雀石綠類包...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳樹兵，陳先鋒，李雙，朱海強，方科益，勞華均，
申請(專利權)人：寧波出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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