一類磷酸化精氨酸類似物及其合成方法與應(yīng)用技術(shù)

一類磷酸化精氨酸類似物及其合成方法與應(yīng)用，涉及磷酸化精氨酸類似物。所述一類磷酸化精氨酸類似物以磷酰基乙脒結(jié)構(gòu)為主體。所述一類磷酸化精氨酸類似物可以作為半抗原，用于制備識(shí)別蛋白上pArg的抗體；應(yīng)用一類磷酸化精氨酸類似物所制備的抗體，具有識(shí)別pArg的專一性，與蛋白質(zhì)中常見的其他磷酸化修飾形式交叉反應(yīng)性低；另外，應(yīng)用一類磷酸化精氨酸類似物所制備的小鼠多克隆抗體，主要為IgG2a型，可用于篩選單克隆抗體。還可作為蛋白磷酸化精氨酸酯酶的抑制劑，作為研究該類酯酶生物功能的生化試劑，或針對(duì)該類酯酶進(jìn)行藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。

A class of phosphorylated arginine analogues and its synthesis and Application

The present invention relates to a kind of phosphorylated arginine analogue and its synthesis method and application. The present invention relates to a class of phosphorylated arginine analogues, which are mainly composed of the structure of phosphoryl. The phosphorylated arginine analogues can be used as a hapten for preparing protein identification pArg antibody; application of a class of phosphorylated arginine analogues of the prepared antibody specificity with recognition of pArg, and other common phosphate in protein modification form low cross reactivity; in addition, the application of a class of phosphorylated arginine analogues of the prepared polyclonal antibody, mainly IgG2 type, can be used for the screening of monoclonal antibody. The invention also can be used as an inhibitor of protein phosphorylation arginine esterase, as a biochemical reagent for studying the biological function of the esterase, or a lead compound for the development of the medicine for the esterase.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及磷酸化精氨酸類似物，尤其是涉及一類磷酸化精氨酸類似物及其合成方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是生物界最普遍、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，也是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵機(jī)制之一[1]。與生物學(xué)中廣泛研究的發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側(cè)鏈上的O-磷酸化相比，蛋白質(zhì)上精氨酸的磷酸化(pArg)作為一種新穎的翻譯后修飾形式，大量存在于細(xì)菌等原核生物中[2]，并被認(rèn)為參與細(xì)菌內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3]、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和響應(yīng)外界刺激等重要的生物過程[4]。然而，由于pArg本身在抗原呈遞過程中不穩(wěn)定，無法通過直接免疫動(dòng)物獲得有效的抗體，針對(duì)蛋白中pArg的抗體還未見報(bào)道，因此對(duì)pArg生物學(xué)功能的研究進(jìn)展緩慢。除此之外，pArg還具有對(duì)酸、熱等條件敏感、在很多生化分析條件下不穩(wěn)定等特殊的性質(zhì)[5]。發(fā)展特異性識(shí)別蛋白質(zhì)上磷酸化精氨酸的抗體，可以拓展科學(xué)界對(duì)pArg生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)以pArg為核心的上游激酶、下游酯酶的功能研究及相應(yīng)的藥物發(fā)現(xiàn)。根據(jù)現(xiàn)有的有限的研究結(jié)果，游離狀態(tài)的磷酸化精氨酸(pArg)可能參與以下重要的生物學(xué)功能：1)作為無脊椎動(dòng)物體中的ATP和能量緩沖庫。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低時(shí)，pArg可作為高能物質(zhì)和磷酸根供體，直接與ADP合成ATP。2)作為一些細(xì)胞膜離子泵的調(diào)節(jié)物質(zhì)。某些細(xì)胞膜離子運(yùn)輸復(fù)合物是受以ATP為磷酸基團(tuán)供體的磷酸化-去磷酸化過程提供能量支持和活性調(diào)控的，由于ATP可由pArg直接合成，所以pArg可以間接地調(diào)控細(xì)胞膜上離子運(yùn)輸復(fù)合物的活性和功能。3)作為細(xì)胞內(nèi)有氧代謝供能轉(zhuǎn)向無氧代謝供能的一個(gè)中介物質(zhì)。在細(xì)胞活動(dòng)中，只有當(dāng)代謝加劇而線粒體不能及時(shí)產(chǎn)生足夠的ATP時(shí)，pArg才充當(dāng)起ATP的合成和緩沖庫的功能。然而，由于pArg本身也由ATP合成，所以在機(jī)體受到較大應(yīng)激條件時(shí)，pArg的緩沖能力有限，只能滿足部分ATP合成所需的能量。厭氧反應(yīng)(糖酵解過程)在能量需求高峰期發(fā)揮了提供ATP的主要作用，所以，pArg在一定程度上可能是有氧代謝供能轉(zhuǎn)向無氧代謝供能的一個(gè)中間物質(zhì)。4)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值。在動(dòng)物體受到代謝應(yīng)激時(shí)，pArg可以通過自發(fā)或酶促的水解過程，捕捉并束縛細(xì)胞內(nèi)的H+，降低細(xì)胞液中的[H]+并提高[P3O4]3-的濃度，提高細(xì)胞液緩沖能力，維持細(xì)胞內(nèi)的pH值。5)pArg還可以影響到機(jī)體的磷酸化能力并進(jìn)而影響生長。磷酸化能力的降低導(dǎo)致高能磷酸鹽只被充分用于維持基本的細(xì)胞活動(dòng),而阻礙了機(jī)體的其他活動(dòng)如生長和發(fā)育,例如一些軟體動(dòng)物的面盤幼體外殼將會(huì)由于高能磷酸鹽的減少而變形。最近，對(duì)蛋白質(zhì)上磷酸化精氨酸的研究有了一些新進(jìn)展。2009年，TimClausen發(fā)現(xiàn)并鑒定出原核生物中第一個(gè)蛋白精氨酸激酶-McsB，并研究了其可能參與的調(diào)控功能[3]；2012年，在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)磷酸化精氨酸的磷酸酯酶-YwlE，并通過質(zhì)譜技術(shù)，在以枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌模型,鑒定出87個(gè)蛋白中121個(gè)精氨酸磷酸化位點(diǎn)[6]。由于目前還沒有針對(duì)pArg的抗體，因此急需建立制備anti-pArg抗體的方法，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行更深入的研究。國際上目前針對(duì)酸不穩(wěn)定N-磷酸的蛋白的檢測(如：磷酸化組氨酸)，發(fā)展了應(yīng)用與檢測抗原在結(jié)構(gòu)上近似的類似物進(jìn)行免疫，制備識(shí)別真實(shí)抗原的抗體的策略[7-8]。參考文獻(xiàn)：1.TonyHunter.Cell,2000,100,113-127.2.Elsholz,A.K.W.,K.Turgay,etal.ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(19),7451-7456.3.Fuhrmann,J.,A.Schmidt,etal.Science,2009,324(5932),1323-1327.4.SchmidtA.；TrentiniDB.；SpiessS.；FuhrmannJ.；AmmererG.；MechtlerK.；ClausenT.MolCellProteomics,2014,13,537-550.5.Besant,P.G.；Attwood,P.V.；Piggott,M.J.CurrentProteinandPeptideScience,2009,10,536-5506.Elsholz,AlexanderK.W.Turgay,Becher,Hecker,Michael.Gerth,Ulf.Proc.Nati.Acad.Sci.,2012,47,10335-10337.7.Jung-MinKee,BryeannaVillani,LauraR.Carpenter,andTomW.Muir.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(41),14327–14329.8.Kee,J.M.,R.C.Oslund,etal.NatureChemicalBiology.,2013.9(7):416-428.
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一類磷酸化精氨酸類似物及其合成方法與應(yīng)用。所述一類磷酸化精氨酸類似物以磷酰基乙脒結(jié)構(gòu)為主體，一類磷酸化精氨酸類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：所述一類磷酸化精氨酸類似物(pArganalog)的合成路線如下：其中，Z基團(tuán)包括R基團(tuán)包括R2，R3,R4,R5,R6,R7,R8分別表示獨(dú)立的氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜環(huán)，雜環(huán)環(huán)烷基，或磷酸酯保護(hù)基；X代表一種化學(xué)鍵或一種連接基團(tuán)，范圍包括烯烴，亞烯烴，亞炔烴，環(huán)烯烴，環(huán)炔烴，雜環(huán)烯，-(O-CH2-CH2)n-,或–(CH2)q,以及–(CH2)q中任意-CH2基團(tuán)被-O-取代；n取值1～100；q取值1～6；Y包括H，-OR9,-NR9R10,-SR9,-COOR9,-C(O)NR9R10,-NHJ或者-C(O)Q；R9和R10分別表示獨(dú)立的氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜環(huán)，雜環(huán)環(huán)烷基；J代表一種氨基保護(hù)基團(tuán)；Q代表一種羧酸保護(hù)基團(tuán)。所述R可表示所述R2和R3可表示H。所述X可表示烷烴連接基團(tuán)或-CH2-CH2-。所述Y可表示-NR9R10，-NHJ；所述R9和R10可表示H。所述R可代表R2和R3代表H；X代表-CH2-CH2-；Y代表-NR9R10而R9、R10代表H。本專利技術(shù)通過上述合成方法獲得與天然pArg在結(jié)構(gòu)上類似、未見文獻(xiàn)報(bào)道的新穎的一類磷酸化精氨酸類似物(pArg類似物)，所述一類磷酸化精氨酸類似物可以作為半抗原，用于制備識(shí)別蛋白上pArg的抗體；應(yīng)用一類磷酸化精氨酸類似物(如pAIE)所制備的抗體，具有識(shí)別pArg的專一性，與蛋白質(zhì)中常見的其他磷酸化修飾形式(如pSer\\pThr\\pTyr等)交叉反應(yīng)性低；另外，應(yīng)用一類磷酸化精氨酸類似物(如pAIE)所制備的小鼠多克隆抗體，主要為IgG2a型，可用于篩選單克隆抗體。所述一類磷酸化精氨酸類似物還可作為蛋白磷酸化精氨酸酯酶(如YwlE)的抑制劑(inhibitor)，作為研究該類酯酶生物功能的生化試劑，或針對(duì)該類酯酶進(jìn)行藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。本專利技術(shù)提供一種抗體的制備流程，該流程由免疫動(dòng)物開始(例如，哺乳動(dòng)物)，通過反復(fù)用前述免疫原實(shí)施免疫，之后從免疫動(dòng)物身上收集血清，并使用生物常規(guī)技術(shù)分離血清中的抗體，如實(shí)施例2所示。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一類磷酸化精氨酸類似物，其特征在于以磷酰基乙脒結(jié)構(gòu)為主體，一類磷酸化精氨酸類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

【技術(shù)特征摘要】
1.一類磷酸化精氨酸類似物，其特征在于以磷酰基乙脒結(jié)構(gòu)為主體，一類磷酸化精氨酸類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：2.如權(quán)利要求1所述一類磷酸化精氨酸類似物的合成路線如下：其中，Z基團(tuán)包括R基團(tuán)包括R2，R3,R4,R5,R6,R7,R8分別表示獨(dú)立的氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜環(huán)，雜環(huán)環(huán)烷基，或磷酸酯保護(hù)基；X代表一種化學(xué)鍵或一種連接基團(tuán)，范圍包括烯烴，亞烯烴，亞炔烴，環(huán)烯烴，環(huán)炔烴，雜環(huán)烯，-(O-CH2-CH2)n-,或–(CH2)q,以及–(CH2)q中任意-CH2基團(tuán)被-O-取代；n取值1～100；q取值1～6；Y包括H，-OR9,-NR9R10,-SR9,-COOR9,-C(O)NR9R10,-NHJ或者-C(O)Q；R9和R10分別表示獨(dú)立的氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，雜環(huán)，雜環(huán)環(huán)烷基；J代表一種氨基保護(hù)基團(tuán)；Q代表一種羧酸保護(hù)基團(tuán)。3.如權(quán)利要求2所述合成路線，其特征在于所述R表示所述R2和R3可表示H；所述X可表示烷烴連接基團(tuán)或-CH2-CH2-。4.如權(quán)利要求2所述合成路線，其特征在于所述Y表示-NR9R10，-NHJ；所述R9和R10表示H。5.如權(quán)利要求2所述合成路線，其特征在于所述R代表R2和R3代表H；X代表-CH2-CH2-；Y代表-NR9R10而R9、R10代表H。6.如權(quán)利要求1所述一類磷酸化精氨酸類似物的應(yīng)用，其特征在于所述一類磷酸化精氨酸類似物作為...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙玉芬，付川，歐陽翰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廈門大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35