得自類桿菌屬的巖藻糖苷酶及其用途制造技術

本發明專利技術涉及得自類桿菌屬的巖藻糖苷酶及其用途。本發明專利技術揭示關于具有α?(1,2)、α?(1,3)、α?(1,4)及α?(1,6)巖藻糖苷酶活性的α?巖藻糖苷酶。本揭示亦關于包括所述α?巖藻糖苷酶的組合物，及產生所述α?巖藻糖苷酶及使用所述α?巖藻糖苷酶裂解糖偶聯物中的α?(1,2)、α?(1,3)、α?(1,4)及/或α?(1,6)?連接巖藻糖的方法。因此，本發明專利技術提供用于在活體外改良巖藻糖的酶水解的組合物及方法。特定而言，本發明專利技術可用于有效裂解天然糖蛋白中的核心巖藻糖且糖蛋白并無變性或功能劣化。本發明專利技術的組合物及方法可促進Fc融合蛋白或抗體(例如治療抗體)的Fc糖改造。

Glycosidase derived from Bacteroides and its use

The invention relates to an enzyme obtained from Bacteroides and its use. The invention discloses a with alpha (1,2), alpha (1,3), alpha (1,4) and alpha (1,6) alpha fucosidase fucosidase activity. This is a page of a composition comprising the alpha fucosidase, alpha and generate the alpha fucosidase and the use of the alpha fucosidase cracking sugar conjugates in (1,2), alpha (1,3), alpha (1,4) and / or alpha (1,6) methods connected fucose. Thus, the present invention provides compositions and methods for enzymatic hydrolysis of modified fucose in vitro. In particular, the present invention can be used for the efficient cleavage of the core fucose in the natural glycoprotein and has no denaturation or deterioration of function. The compositions and methods of the present invention may facilitate the transformation of Fc fusion proteins or antibodies (e.g., therapeutic antibodies) to Fc sugars.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請案本專利技術主張以下優先權：美國臨時申請案美國申請序號(USSN)62/003,136，申請于2014年5月27日、USSN62/003,104，申請于2014年5月27日、USSN62/003,908，申請于2014年5月28日，USSN62/020,199申請于2014年7月2日及USSN62/110,338，申請于2015年1月30日。其內容以全文引用方式并入本文中。
技術介紹
巖藻糖系糖偶聯物的許多O-或N-連接寡糖結構的重要組份。含巖藻糖聚糖涉及諸多生物事件(包含發育及細胞凋亡)，且涉及發炎、癌癥及囊性纖維化的發病機制。糖偶聯物的去巖藻糖基化系理解糖偶聯物的生物效應的重要過程。α-L-巖藻糖苷酶(α-巖藻糖苷酶)系糖苷外切酶，其負責通過水解巖藻糖中主要附接至半乳糖或N-乙酰基葡糖胺的α-(1,2)、α-(1,3)、α-(1,4)及α-(1,6)鏈接自糖偶聯物的非還原端去除巖藻糖殘基。眾所周知，人類血清IgG及治療抗體可發生重度巖藻糖基化。已發現，抗體依賴性細胞毒性(ADCC)系負責治療抗體的臨床功效的重要效應物功能的一。在淋巴球受體(FccR)結合至抗體Fc區后，ADCC得以觸發。ADCC活性取決于經由α-(1,6)鏈接附接至N-連接Fc寡糖的最內GlcNAc的巖藻糖的量。
技術實現思路
因此，本專利技術提供用于在活體外改良巖藻糖的酶水解的組合物及方法。特定而言，本專利技術可用于有效裂解天然糖蛋白中的核心巖藻糖且糖蛋白并無變性或功能劣化。本專利技術的組合物及方法可促進Fc融合蛋白或抗體(例如治療抗體)的Fc糖改造。本專利技術亦應用聚糖測序來辨別糖偶聯物上的巖藻糖位置。糖偶聯物可為糖脂、糖蛋白、寡糖或糖肽。在一態樣中，本專利技術系關于包括與SEQIDNO:1具有至少85％序列一致性的多肽的α-巖藻糖苷酶。在一些實施例中，α-巖藻糖苷酶包括與SEQIDNO:1具有至少88％序列一致性的多肽。在一些實施例中，α-巖藻糖苷酶包括與SEQIDNO:1具有序列一致性的多肽。在某些實施例中，α-巖藻糖苷酶包括與SEQIDNO:2具有序列一致性的多肽。SEQIDNO:1及2共有88％序列一致性。本文所闡述的巖藻糖苷酶可水解一或多種α(1,2)、α(1,3)、α(1,4)及α(1,6)-連接巖藻糖。巖藻糖可存在于糖偶聯物中的N-及/或O-連接聚糖中。在某些實施例中，α-巖藻糖苷酶系重組類桿菌屬(Bacteroides)α-巖藻糖苷酶。在優選實施例中，α-巖藻糖苷酶展現4-9的最佳pH。在另一態樣中，本專利技術系關于包括上文所闡述α-巖藻糖苷酶的組合物。所述組合物可進一步包括至少一種糖苷酶。在一些實施例中，糖苷酶可為糖苷外切酶。糖苷外切酶包含但不限于唾液酸酶、半乳糖苷酶、α-巖藻糖苷酶及其變體。在一些實施例中，糖苷酶可為糖苷內切酶。糖苷內切酶包含但不限于內-β-N-乙酰基胺基葡萄糖苷酶(NAG)、EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS及其變體。本專利技術組合物可用于在活體外對糖偶聯物進行去巖藻糖基化。特定而言，本文所闡述的組合物可用于在活體外對糖蛋白進行核心去巖藻糖基化。在一些實施例中，核心去巖藻糖基化系核心α(1,6)去巖藻糖基化。在某些實施例中，核心去巖藻糖基化系核心α(1,3)去巖藻糖基化。去巖藻糖基化可在糖蛋白并無變性或功能劣化下實施。本專利技術的另一態樣提供在活體外對糖偶聯物進行去巖藻糖基化的方法。專利技術性方法包括使糖偶聯物與上文所闡述本專利技術的α-巖藻糖苷酶接觸的步驟。糖偶聯物包括一或多種選自α(1,2)、α(1,3)、α(1,4)及α(1,6)-連接巖藻糖的巖藻糖。巖藻糖可存在于糖偶聯物中的N-及/或O-連接聚糖中。在一些實施例中，糖偶聯物系糖蛋白。在一些實施例中，糖蛋白包括核心巖藻糖。在一些實施例中，核心巖藻糖系核心α-(1,3)-連接巖藻糖或核心α-(1,6)-連接巖藻糖。在一些實施例中，所述方法進一步包括使糖偶聯物與至少一種糖苷酶接觸。在某些實施例中，糖苷酶系糖苷內切酶。使用糖苷內切酶修剪N-聚糖中的寡糖的可變部分。本文所使用的糖苷內切酶的實例包含但不限于Endo-β-N-乙酰基胺基葡萄糖苷酶(NAG)、EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS及其變體。糖苷外切酶對于核心去巖藻糖基化而言，可使用糖苷內切酶及α-巖藻糖苷酶依序或同時處理糖偶聯物。核心去巖藻糖基化可為核心α(1,3)去巖藻糖基化或α(1,6)去巖藻糖基化。本專利技術一或多個實施例的詳細內容陳述于下文說明書中。根據下列圖式及若干實施例的詳細說明亦及隨附申請專利范圍，本專利技術的其他特征或優點將顯而易見。附圖說明圖1.展示BfFucH的生物化學性質。圖2.(a)BfFucH的pH特征(b)對BfFucH的酶活性的溫度效應(c)對BfFucH的酶活性的金屬離子效應。圖3.展示Rituxan的BfFucH處理的時間過程。具體實施方式在Fc聚糖中不存在核心巖藻糖殘基已知會實質上增加IgG的ADCC活性，此乃因非巖藻糖基化抗體以顯著增加的親和力結合至FcgRIIIα受體。為改良FcgRIIIα結合及ADCC，已研發若干策略來減小IgG的巖藻糖基化，包含研發的廢除或減小α-(1,6)巖藻糖基轉移酶的表達程度的細胞系產生。減小巖藻糖基化的替代策略包含使用RNAi使α-(1,6)巖藻糖基轉移酶基因沉默。然而，N-聚糖的核心去巖藻糖基化不能在活體外以酶方式達成，此主要系由于N-聚糖埋入兩個Fc結構域之間。酶去巖藻糖基化效率因空間阻礙(亦即，α-巖藻糖苷酶至巖藻糖殘基的接近由Fc結構域的位置阻斷)而極低。業內已知諸多α-巖藻糖苷酶。實例包含來自角蠑螺(Turbocornutus)、白法螺(Charonialampas)、類炭疽桿菌(Bacillusfulminans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、牛腎(Glyko)、雞肝的α-巖藻糖苷酶(Tyagarajan等人，1996,Glycobiology6:83-93)及來自木薯單孢萎蔫病(Xanthomonasmanihotis)的α-巖藻糖苷酶II(Glyko,PROzyme)。一些巖藻糖苷酶亦市面有售(尤其系Glyko,Novato,Calif.；PROzyme,SanLeandro,Calif.；Calbiochem-Novabiochem公司，SanDiego,Calif.)。這些α-巖藻糖苷酶不能有效裂解自N-連接聚糖的核心巖藻糖且糖蛋白并不首先變性。WO2013/12066揭示通過來自牛腎的α-巖藻糖苷酶對(Fucαl,6)GlcNAc-利妥昔單抗實施去巖藻糖基化。如WO2013/12066中所闡述，將(Fucαl,6)GlcNAc-利妥昔單抗的反應混合物與來自牛腎的α-巖藻糖苷酶(自Prozyme購得)在37℃下一起培育20天以完全去除(Fucαl,6)GlcNAc-利妥昔單抗中的巖藻糖。業內已知免疫球蛋白的熱不穩定性(Vermeer等人，BiophysJ.Jan78:394-404(2000))。Fab片段對熱處理最敏感，而Fc片段對本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種組合物，其包括含有與SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2具有至少85％序列一致性的多肽的α?巖藻糖苷酶及至少一種糖苷酶。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.05.27 US 62/003,136;2014.05.27 US 62/003,104;1.一種組合物，其包括含有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少85％序列一致性的多肽的α-巖藻糖苷酶及至少一種糖苷酶。2.如權利要求1的組合物，其中所述α-巖藻糖苷酶包括與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少88％序列一致性的分離多肽。3.如權利要求1至2的組合物，其中所述α-巖藻糖苷酶包括具有SEQIDNO:1中所述氨基酸序列的分離多肽。4.如權利要求1至2的組合物，其中所述α-巖藻糖苷酶包括具有SEQIDNO:2中所述氨基酸序列的分離多肽。5.如權利要求1的組合物，其中所述糖苷酶是糖苷內切酶。6.如權利要求4的組合物，其中所述糖苷內切酶選自由以下組成的群：內-β-N-乙酰基胺基葡萄糖苷酶(NAG)、EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS及其變體。7.如權利要求1的組合物，其中所述糖苷酶是糖苷外切酶。8.如權利要求1的組合物，其中所述酶是重組類桿菌屬(Bacteroides)α-L-巖藻糖苷酶。9.如權利要求1的組合物，其中所述酶可水解存在于糖偶聯物中的N-及/或O-連接聚糖中的α-(1,2)、α-(1,3)、α-(1,4)及α-(1,6)-連接巖藻糖。10.如權利要求1的組合物，其中所述α-巖...

【專利技術屬性】
技術研發人員：翁啟惠，蔡宗義，
申請(專利權)人：中央研究院，
類型：發明
國別省市：中國臺灣;71