一種植物組織培養脫毒的外植體及其脫毒方法技術

一種植物組織培養脫毒的外植體及其脫毒方法，取植物莖尖plus作為外植體，將其滅菌處理后進行胚性細胞培養，在胚性細胞培養的基礎上，進行胚狀體誘導培養，在胚狀體誘導培養的基礎上進行莖葉分化培養，然后取無根苗進行病毒檢測，挑選病毒陰性的無根苗繼續進行增殖培養，擴大繁殖量并進行生根培養，篩選適宜的根系馴化、移栽。本發明專利技術優勢在于，操作方便、無需體視顯微鏡也可以較為準確的切割外植體；分化率和成活率很高，提高無毒苗培育率；即使生成極少量的脫毒苗，也可以通過組培快速地繁殖起來，不影響脫毒培養。

Explant for virus-free tissue culture of plants and detoxification method thereof

Removal of explants poison and detoxification method of plant tissue culture, plant stem tip plus as explants, the sterilization of embryogenic cell culture, on the basis of embryogenic cells, for embryoid induction culture, cultured in embryoid induction culture the basis of stem and leaf then take no root differentiation, virus detection, seedlings were cultured to select virus negative, expanding reproduction and rooting culture, selecting and domesticating and transplanting root. The present invention is superior, convenient operation, no stereo microscope can also cut explants accurately; the differentiation rate and the survival rate is very high, improve the non-toxic seedling cultivation rate; even a very small amount of vaccine and generation, also can be propagated rapidly by tissue culture, does not affect the virus-free culture.

【技術實現步驟摘要】
一種植物組織培養脫毒的外植體及其脫毒方法
本專利技術屬于植物脫毒
，特別涉及植物組織培養脫毒外植體脫毒方法。
技術介紹
病毒對植物危害嚴重，病毒可導致植物樹體衰弱，果實變小并且畸形，品質變劣，產量嚴重下降，病毒病屬于難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物。因此，培育無病毒植物苗木已經成為防止病毒危害的主要措施。目前通常采用的培育無病毒植物苗木的方法是莖尖組織培養技術。莖尖培養可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒(或脫毒)植株。莖尖培養，有時也稱微莖尖培養，此處所稱的莖尖實質是指莖尖的分生區。莖尖培養是利用莖尖的分生區為分生組織，其中無病毒的原理，通過組織培養實現脫除病毒的目的。但莖尖大小對成活率和脫毒率有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；反之，如果莖尖越小，雖然脫毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植體死亡，造成組織培養脫毒失敗。
技術實現思路
為解決傳統的莖尖培養法培育脫毒苗時，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種后的外植體死亡的問題，本專利技術提供一種植物組織培養脫毒外植體，使得組織培養脫毒操作變得更加簡單，大大提高分化率和成活率，使得脫毒的成功率提高。從莖的結構上看，分生區的形態學下方是伸長區，該區域為分生區和成熟區的過渡區，伸長區的組成既有成熟組織，也有分生組織。根據這一結構的特殊性，可以認為伸長區與分生區具有相似性，因為其中也含有分生組織，故也可以參與植物脫毒苗的培育。專利技術人將莖尖的分生區與伸長區(甚至包括少部分成熟區的組織)結合在一起，稱其為莖尖plus。在專利技術人的研究中發現，莖尖plus作為外植體，采取誘導胚狀體的方式可以培育出脫毒苗。采用莖尖plus作為外植體時，首先要誘導出胚性細胞，然后誘導胚狀體和莖葉分化的培養，最后進行生根培養、馴化與移栽。本專利技術采用的技術方案如下：一種植物組織培養脫毒的外植體，該外植體為植物莖尖plus，包括植物莖的分生區和伸長區。采用上述植物組織培養脫毒的外植體脫毒方法，包括以下步驟：取植物莖尖plus作為外植體，將其滅菌處理后進行胚性細胞培養，在胚性細胞培養的基礎上，進行胚狀體誘導培養，在胚狀體誘導培養的基礎上進行莖葉分化培養，然后取無根苗進行病毒檢測，挑選病毒陰性的無根苗繼續進行增殖培養，擴大繁殖量并進行生根培養，篩選適宜的根系馴化、移栽。進一步的，上述方法包括以下步驟：(1)將休眠季或生長季的植物莖尖plus作為外植體用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中滅菌20～40min；(2)滅菌后的外植體立即接種在最適胚性細胞培養基中，經8～10周培養形成大量的胚性細胞團后，轉移到最適胚狀體誘導培養基中培養；(3)經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養基上培養；(4)待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量后再將其轉到生根培養基中進行生根培養，(5)待長出良好的根系后馴化、移栽。進一步的，所述的最適胚性細胞培養基包括：1.0～3.5mg/L6-BA，0.1～0.8mg/LNAA。進一步的，所述的最適胚狀體誘導培養基包括：0.5～4.0mg/L6-BA。進一步的，所述的最適莖葉分化培養基包括：0.01～0.05mg/L6-BA。進一步的，所述的生根培養基包括：0.2～3.5mg/LIBA。所述的馴化為：將長出良好的根系轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化。進一步的，所述步驟(5)中，馴化后將根系移栽在中性土壤中。本專利技術另一個目的是請求保護雙子葉植物莖尖plus在組織培養脫毒中的應用。采用莖尖plus作為外植體，在脫除植物病毒方面具有如下優勢：1、操作方便。傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由于所取外植體太小(一般外植體長度不超過1mm)，工作人員需要在體視顯微鏡下，才能獲取外植體。而且由于外植體太小，很難用鑷子夾住并將其接種到培養基上，導致操作速度慢，操作不便。采用莖尖plus作為外植體，由于外植體較大(分生區長度1mm左右，伸長區的長度為3～5mm，故莖尖plus的長度為4～6mm)，不存在上述操作難度大等問題，且無需體視顯微鏡也可以較為準確的切割外植體。2、分化率和成活率很高，提高無毒苗培育率。傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種后的外植體死亡，導致實驗研究失敗。采用莖尖plus作為外植體，由于外植體較大，分化率和成活率相對較高。3、采用莖尖plus作為外植體，即使生成極少量的脫毒苗，也可以通過組培快速地繁殖起來，不影響脫毒培養。附圖說明圖1為蘋果主要病毒ACLSVRT-PCR產物電泳圖；圖2為甜櫻桃主要病毒PNRSVRT-PCR產物電泳圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術的技術方案作進一步的說明，但本專利技術不以任何形式受限于實施例內容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業途徑獲得。實施例1：選雙子葉植物“紅富士”蘋果生長期的莖尖plus作為外植體，流水沖洗后，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經8～10周培養形成大量的胚性細胞團后，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+6-BA2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成0.3～1.0cm3小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養基(LS+BA0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，如電泳圖圖1所示。本次檢測的病毒是蘋果主要病毒之一，即蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)。檢測結果為陰性，即圖1中沒有出現長度為358bp病毒特異性片段。然后將無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量后再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系后轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中。脫毒成功率可達到3.5～5.6％。實施例2：選雙子葉植物“紅富士”蘋果休眠期的葉芽，流水沖洗后，剝去芽外面的鱗片，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，切取芽前端的莖尖plus作為外植體，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經8～10周培養形成大量的胚性細胞團后，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+BA2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養基(LS+BA0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是ACLSV。然后將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量后再將其轉到本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種植物組織培養脫毒的外植體，其特征在于，該外植體為植物莖尖plus，包括植物莖的分生區和伸長區。

【技術特征摘要】
1.一種植物組織培養脫毒的外植體，其特征在于，該外植體為植物莖尖plus，包括植物莖的分生區和伸長區。2.一種采用權利要求1所述的植物組織培養脫毒的外植體的脫毒方法，其特征在于，包括以下步驟：取植物莖尖plus作為外植體，將其滅菌處理后進行胚性細胞培養，在胚性細胞培養的基礎上，進行胚狀體誘導培養，在胚狀體誘導培養的基礎上進行莖葉分化培養，然后取無根苗進行病毒檢測，挑選病毒陰性的無根苗繼續進行增殖培養，擴大繁殖量并進行生根培養，篩選適宜的根系馴化、移栽。3.根據權利要求2所述的一種植物組織培養脫毒的外植體的脫毒方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將休眠季或生長季的植物莖尖plus作為外植體用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中滅菌20～40min；(2)滅菌后的外植體立即接種在最適胚性細胞培養基中，經8～10周培養形成大量的胚性細胞團后，轉移到最適胚狀體誘導培養基中培養；(3)經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養基上培養；(4)待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，將檢測結果為陰性的無根苗繼續...

【專利技術屬性】
技術研發人員：侯義龍，
申請(專利權)人：大連大學，
類型：發明
國別省市：遼寧,21