牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法技術

本發明專利技術屬于動物疫病病原快速診斷領域，尤其是一種牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法，由牛支原體液體培養基和牛支原體固體培養基組成，在原有配方的基礎上添加脫氧核糖核苷酸鈉、牛心湯及牛肺消化液，增加了酵母浸出液的用量，減少了血清的添加量。改良后的牛支原體液體培養基接種牛支原體培養24h顏色即可變為黃色，且蛋白含量最高可達1.58?1.69?mg/mL。將培養24h變黃的牛支原體液體培養基接種于牛支原體固體培養基后48h即可觀察到典型的牛支原體“油煎蛋”樣菌落。本發明專利技術的牛支原體培養基提高了牛支原體的生長效率，且提高了牛支原體分離純化的成功率，為牛支原體的快速診斷、治療和防控提供了寶貴的時間，并降低了牛支原體的培養成本。

Special fast culture medium for Mycoplasma bovis and isolation and purification method of Mycoplasma bovis

The invention belongs to the field of rapid diagnosis of animal disease pathogens, especially the separation and purification method of cattle Mycoplasma quick medium and Mycoplasma bovis by Mycoplasma bovis, liquid medium and solid medium composed of Mycoplasma bovis, adding deoxyribonucleate sodium, niuxin Decoction and bovine digestive fluid based on the original formula, adding yeast extract liquid dosage, reduce the concentration of serum. Bovine mycoplasma liquid modified culture medium with bovine mycoplasma culture can 24h color is yellow, and the protein content of up to 1.58 1.69 mg/mL. The Mycoplasma bovis liquid medium 24h was cultured in the solid medium of Mycoplasma bovis. After 48h, typical Mycoplasma bovis \fried egg\ colonies were observed. The invention of the training base to improve the growth efficiency of Mycoplasma bovis Mycoplasma bovis, and improve the success rate of the separation and purification of Mycoplasma bovis, provides valuable time for rapid diagnosis, treatment and prevention of Mycoplasma bovis, and reduce the training cost of Mycoplasma bovis.

【技術實現步驟摘要】
牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法
本專利技術屬于動物疫病病原快速診斷領域，尤其是一種牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法。
技術介紹
牛支原體（Mycoplasmabovis）是感染肉牛和奶牛一種重要的病原微生物，1961年牛支原體首次在美國患有乳腺炎的牛乳中被分離到。牛支原體是一種能夠導致牛發生多種疾病，且感染率極高的重要病原微生物，可以導致牛發生肺炎、關節炎、乳房炎、結膜炎、懷孕母牛流產、生殖器感染等多種疾病，臨床上牛支原體病例多與各種病毒、細菌、寄生蟲的混合感染。隨著經濟不斷的發展和運輸條件的改善，牛只在國與國、地區與地區之間的交易規模不斷的再增加，該病相繼傳播到南美、歐洲及中東等地區，在世界多個國家和地區，牛支原體已經成為一種重要的病原并在多個國家和地區流行，對肉牛和奶牛產業造成重大影響。牛支原體對畜牧業生產造成嚴重的經濟損失，尤其在北美和歐洲，在美國由于牛支原體引起的疾病每年所造成的損失高達1.40億美元，在歐洲每年由于牛支原體引起的犢牛肺炎約為25%～33%，而在美國2015年最新的報告中顯示，近幾年，牛支原體對澳大利亞和美國乳制品和牛肉行業造成巨大的經濟損失，且在逐年遞增，牛支原體現階段不僅引起常見的肺炎，而且引起成年泌乳奶牛的隱形乳房炎和臨床型乳房炎比例也在逐年增多，在臨床型乳房炎病例中，由牛支原體引起的比例已從2003年的3.9%上升到現在的14.4%，在鮮乳中牛支原體檢出率也在逐年增高。1983年黎濟申在我國首次報道了從乳房炎牛乳中分離得到牛支原體，此后我國關于牛支原體的報道極少。2008年湖北省相繼報道從肉牛和犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后重慶、貴州、新疆、寧夏等全國多個省市報道肉牛和奶牛發生牛支原體疾病,至今，全國所有省、自治區都有關于牛支原體疾病和流行病學的相關報道。這表明牛支原體在我國傳播速度快，傳播范圍廣。牛支原體生長時所需要的營養物質主要靠外界攝取獲得，因為牛支原體自身生物合成及代謝能力有限，,因此牛支原體對體外培養基的選擇相當苛刻，關于牛支原體的PCR等診斷技術都需要獲得牛支原體的純培養物及牛支原體典型的油煎蛋樣菌落，而現有牛支原體培養基抑制雜菌能力弱，培養效率低，培養時間長，容易污染、易產生誤診和漏診。因此,為了盡早控制該病在我國的流行，本領域函需高效穩定、快速分離診斷牛支原體的培養基以及分離純化牛支原體的方法,進而開展牛支原體感染的診斷、治療與防控研究。
技術實現思路
本專利技術提供了一種成本相對較低的牛支原體培養基，該牛支原體培養基能夠用來較為快速的分離純化牛支原體，蛋白含量高、生長效率高；本專利技術亦提供了一種應用該培養基分離純化牛支原體的方法，便于快速診斷牛支原體。本專利技術為實現上述目的采用的方案為：牛支原體培養基，包括牛支原體液體培養基和牛支原體固體培養基，所述牛支原體液體培養基由以下成分組成：超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO肉湯、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅。作為優選，所述牛支原體液體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1-2.5mL/L、PPLO肉湯20-23g、滅活馬血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110mL/L、青霉素200-300萬單位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸鈉1.8-2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1-0.3g、牛心湯150-170mL/L、牛肺消化液100-120mL/L和0.4%酚紅4.3-4.6mL/L，剩余體積用超純水補夠。最優選，所述牛支原體液體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO肉湯21g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液200mL/L、青霉素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150mL/L、牛肺消化液100mL/L和0.4%酚紅4.5mL/L，剩余體積用超純水補夠作為優選,所述酵母浸出液的制備方法為:將250g鮮酵母溶于1000mL超純水，攪拌均勻，充分溶解后煮沸15min，快速冷卻，4000r/min離心15min，提取上清液，再煮沸15min，快速冷卻，用K型澄清濾極過濾，再用0.22um無菌濾膜過濾除菌，置4℃保存備用。采用上述方法制備得到的酵母浸出液具備以下優點:攪拌均勻增加了鮮酵母的溶解性，使用K型澄清濾極過濾的浸出液顏色為淡黃色，盡量避免對培養基渾濁度的干擾，使用0.22um無菌濾膜過濾除菌避免了高溫高壓滅菌法對浸出液成份的破壞。作為優選，所述牛心湯的制備方法為：將提出勁健的牛心攪碎，稱取500g混合均勻放入4℃冰箱24h，出去血液和浮油，用紗布包裹隔，加水1000mL煮沸半小時，使肉渣完全凝結成塊并擠壓收集全部濾液，使用0.8um濾膜，加水補足1000mL，加入蛋白胨5g，NaCl0.8g，磷酸鹽0.6g，溶解后校正Ph值7.6-7.8，使用0.22um無菌濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存備用。作為優選，所述牛肺消化液的制備方法為：將健康的牛肺攪碎，稱取600g放入2L燒杯，加入1L超純水，在電爐上加熱至80℃并不斷攪拌。再加入8g/L碳酸鈉溶液1L并攪拌，冷卻至45℃后加入12g胰酶溶液，在45℃條件下水浴3h，過一會攪拌一次并不斷除去液面油脂，邊攪拌邊加入16mL濃鹽酸，加入煮沸15min，先經雙層紗布過濾，3000r/min離心15min，濾紙過濾后煮沸15min，冷卻至室溫，用1moL/LNaOH調pH至7.8，121℃高壓滅菌15min，4℃冰箱保存。本專利技術還提供上述培養基的制備方法,所述液體培養基的制備方法為:將配方量的超純水,10%的醋酸鉑溶液,PPLO肉湯,葡萄糖,丙酮酸鈉,脫氧核糖核苷酸鈉，牛心湯,牛肺消化液，0.4%酚紅充分混勻,調Ph值為7.8,121℃高壓滅菌15分鐘,冷卻至50-55℃,加入配方量的無菌的滅活的馬血清,酵母浸出液,無菌的青霉素水溶液,最后微調Ph值至7.8。作為優選,所述固體培養基的制備方法為:10%的醋酸鉑溶液,PPLO肉湯,葡萄糖,丙酮酸鈉,脫氧核糖核苷酸鈉，牛心湯,牛肺消化液，0.4%酚紅充分混勻,調Ph值為7.8,121℃高壓滅菌15分鐘,冷卻至50-55℃,加入配方量的無菌的滅活的馬血清,酵母浸出液,無菌的青霉素水溶液,最后微調Ph值至7.8。混勻后倒平板,得固體培養基。本專利技術的第三個目的是提供牛支原體分離純化的方法,包括以下步驟:1.用無菌棉簽在牛的鼻腔、病死解剖牛的氣管、喉頭、肺臟、胸腔或腫大的關節采樣，或無菌條件下剪切小塊病樣組織接種到5mL的液體培養基中并棄去棉簽,置于37℃、5%CO2培養箱中培養,48h液體培養基均變黃，略微渾濁，經0.22μm濾膜過濾，過濾液體傳代培養，傳至第3代液體培養基變為黃色，澄清透明，無沉淀。2.將傳至第3代液體培養基轉接固體培養基培養3d長出針尖大小菌落，40倍顯微鏡下呈現牛支原體典型的“油煎蛋”樣菌落，用接種環無菌刮取平板上的菌落接種到新的液體培養基中培養生長,再將變黃的培養物接種到固體培養基上;重復該步驟3次,確保分離到牛支原體特征菌落。步驟1和2表明，由于牛支原體病通常都是牛支原體和其它細菌的混合感染，其它細菌同時也生長或抑制牛支原本文檔來自技高網...

【技術保護點】
牛支原體培養基,其特征在于:由液體培養基和固體培養基組成,所述液體培養基由以下組分組成:?超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO肉湯、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅；所述固體培養基由以下組分組成:?超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO瓊脂、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅。

【技術特征摘要】
1.牛支原體培養基,其特征在于:由液體培養基和固體培養基組成,所述液體培養基由以下組分組成:超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO肉湯、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅；所述固體培養基由以下組分組成:超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO瓊脂、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅。2.根據權利要求1所述的培養基,其特征在于:所述液體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液1-2.5mL/L、PPLO肉湯20-23g、滅活馬血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110mL/L、青霉素200-300萬單位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸鈉1.8-2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1-0.3g、牛心湯150-170mL/L、牛肺消化液100-120mL/L和0.4%酚紅4.3-4.6mL/L，剩余體積用超純水補夠；作為優選，所述牛支原體液體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO肉湯21g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液100mL/L、青霉素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150mL/L、牛肺消化液100mL/L和0.4%酚紅4.5mL/L，剩余體積用超純水補夠。3.根據權利要求1或2所述的培養基,其特征在于：所述固體培養基配方為：所述牛支原體固體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1-2.5mL/L、PPLO瓊脂30-33g、滅活馬血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110mL/L、青霉素200-300萬單位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸鈉1.8-2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1-0.3g、牛心湯150-170mL/L、牛肺消化液100-120mL/L和0.4%酚紅4.3-4.6mL/L，剩余體積用超純水補夠；作為優選，所述牛支原體固體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO瓊脂30g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液100mL/L、青霉素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150mL/L、牛肺消化液100mL/L和0.4%酚紅4.5mL/L，剩余體積用超純水補夠。4.根據權利要求1-3任一所述的培養基,其特征在于：所述酵母浸出液的制備方法為:將250g鮮酵母溶于1000mL超純水，攪拌均勻，充分溶解后煮沸15min，快速冷卻，4000r/min離心15min，提取上清液，再煮沸15min，快速冷卻，用K型澄清濾極過濾，再用0.22um無菌濾膜過濾除菌，置4℃保存備用...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何生虎，郭澍強，郭亞男，
申請(專利權)人：寧夏大學，
類型：發明
國別省市：寧夏,64