用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法及其應用技術

本發明專利技術涉及一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法及其應用，包括：蓋玻片的處理、聚合物涂層的制備、人類脂肪干細胞在聚合物涂層上的長期培養、誘導人類脂肪干細胞向成脂、成骨、成軟骨細胞的分化和對誘導后的三種成體細胞分別進行染色定性；單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環己酯L、甲基丙烯酸?2?(二乙氨基)乙酯K；聚合物涂層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數字為各單體的質量比。本發明專利技術的有益效果是：基于丙烯酸酯類/丙烯酰胺類的聚合物涂層具有良好的光學透明度以及生物相容性，有利于細胞培養與觀察，聚合物涂層不僅可以促進人類脂肪干細胞的生長保持其增殖能力，而且還能保持其干細胞特性。

Preparation of polymer coating for long-term culture of human adipose derived stem cells and use thereof

The present invention relates to a polymer coating for the long-term culture of human adipose derived stem cells in vitro and the preparation method and application thereof, including: processing, polymer coated glass preparation, and cultivation of human adipose derived stem cells in the polymer coating to induce long-term adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation of three a body of the induced cells were stained qualitative human adipose stem cells; monomer: hydroxyethyl methacrylate A, methacrylatoethyl trimethyl ammonium chloride solution, three E cyclohexyl methacrylate, methacrylic acid L 2 (two ethylamino) ethyl K; polymer coating: E1K1L1 E3K1L2, E3A1L2, digital for the monomer mass ratio. The invention has the advantages that the polymer coating of acrylate / acrylamide based on optical transparency and good biocompatibility, and is conducive to the observation of cell culture, polymer coating can not only promote the growth of cells to maintain its proliferation ability of human adipose stem, but also maintain the characteristics of stem cells.

【技術實現步驟摘要】
用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法及其應用
本專利技術涉及一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法及其應用。
技術介紹
間充質干細胞(MSCs)由于其多能性以及免疫調節的能力在再生醫學中越來越受到重視，但它們在體外長期培養擴增并保持其性能以用于臨床治療仍是一個挑戰，因此建立確定的安全培養系統來擴增細胞以用于臨床治療至關重要。盡管標準的TCP培養板足以支持MSCs從最初的異質組織分離物中分離和附著，但它不能夠確保這些干細胞在體外長期培養生長后的多能特性。事實上，已經有研究表明MSCs在TCP上長期培養可能會降低其向成骨和成脂細胞分化的能力。另外，使用動物衍生基質如明膠、膠原蛋白或纖連蛋白作為培養基質也有不足，可能存在很多不確定因素，如存在批次差異，有引起病原體轉移感染的風險。因此，為了保持MSCs完整的臨床應用潛力，開發一種組成確定的合成基材對于MSCs的體外長期培養是迫切需要的。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是：基于上述問題，本專利技術提供一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法及其應用。本專利技術解決其技術問題所采用的一個技術方案是：一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，包括以下步驟：a、蓋玻片的處理：用等離子表面清洗機對蓋玻片正反兩面進行處理，然后將處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，放置一段時間，取出，溶劑淋洗，自然風干，備用；b、聚合物涂層的制備：將單體、交聯劑、紫外光引發劑和溶劑按比例混合均勻，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將步驟a得到的蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣，紫外聚合，得到聚合物涂層；步驟b中單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環己酯L、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯K，聚合物涂層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數字為各單體之間的質量比。進一步地，步驟a中等離子表面清洗機功率500w，時間120s；蓋玻片的規格為φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的體積比為60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。進一步地，步驟a中處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，在恒溫振蕩器震蕩24h后，取出蓋玻片，用丙酮清洗2～3次，自然風干，保存在-25℃冰箱中待用。進一步地，步驟b中交聯劑為N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺，紫外光引發劑為1-羥環己基苯酮，溶劑為1-甲基-2-吡咯烷酮，單體固含量為50％，交聯劑和紫外光引發劑分別占單體總質量的10％和5％，步驟b中聚合物溶液為10μL。進一步地，步驟b中聚合物涂層具體制備方法為：用365nm紫外光照射30min后，將PET薄膜剝離，得到復合有聚合物涂層的載玻片，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風干。用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的應用，包括：c、人類脂肪干細胞在聚合物涂層上的長期培養：收集人類脂肪干細胞消化并計數，接種到聚合物涂層表面進行長期體外培養；d、誘導人類脂肪干細胞向成脂、成骨、成軟骨細胞的分化：待c中的人類脂肪干細胞生長至80％融合時，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導培養液，以加入L-DMEM培養基組作為陰性對照組于培養箱中培養。e、對誘導后的三種成體細胞分別進行染色定性：成脂、成骨、成軟骨細胞誘導一段時間后分別進行油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍染色，然后進行拍照觀察。進一步地，c中聚合物涂層表面進行長期體外培養的具體操作為：收集第2代人類脂肪干細胞，將細胞濃度調整為1×105/mL，接種于載玻片的聚合物涂層上，載玻片置于6孔板中，每孔加2.5mL細胞懸液，用一個沒有聚合物涂層的TC板作為對照組；每3天換一次培養液，待對照組的細胞長到90％融合時，將所有實驗組及對照組的細胞分別脫壁計數，仍按1×105/mL的濃度分別接種于對應的聚合物涂層表面進行傳代長期培養。進一步地，d中三種誘導培養液為：成脂誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-異丁基甲基黃嘌呤、10μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛；成骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸；成軟骨誘導培養液：含10％FBS的H-DMEM、10-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗壞血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸鈉、50mg/mLITS、100ng/mLTGF-β3。進一步地，d中人類脂肪干細胞于37℃、5％CO2的培養箱中培養，每3d換液1次。進一步地，e中三種誘導后的成體細胞染色具體操作為：成脂誘導3周后進行油紅O染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min后用PBS沖洗兩次，用0.1μg/mLDAPI染色20min后用PBS沖洗兩次，再用60％的異丙醇溶液浸洗5min，然后再加入油紅O染色液室溫染色30min，最后用60％異丙醇水溶液清洗2-3次后用顯微鏡進行拍照觀察；成骨誘導4周后進行茜素紅染色：吸棄培養液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，后用PBS沖洗兩次，然后用2％的茜素紅水溶液染色20min，最后用PBS緩沖液清洗2-3次后進行拍照觀察；成軟骨誘導4周后進行阿利新藍染色：細胞進行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS沖洗兩次，加Alcian酸化液浸泡3min，然后加Alcian染色液染色15-30min，最后用去離子水沖洗2-3次后進行拍照觀察。本專利技術的有益效果是：基于丙烯酸酯類/丙烯酰胺類的聚合物涂層具有良好的光學透明度以及生物相容性，有利于細胞培養與觀察，聚合物涂層不僅可以促進人類脂肪干細胞的生長保持其增殖能力，而且還能保持其干細胞特性，這些新的聚合物為人類脂肪干細胞用于研究、工業化擴增和臨床應用的長期培養提供了一種高效、安全的、化學組成可控的合成基材。附圖說明下面結合附圖對本專利技術進一步說明。圖1為實施例2的聚合物涂層E3K1L2的紅外譜圖；圖2為3個實施例的聚合物涂層的熱失重曲線；圖3為3個實施例的聚合物涂層培養的人類脂肪干細胞分化成成脂細胞的分化率對比圖。具體實施方式現在結合具體實施例對本專利技術作進一步說明，以下實施例旨在說明本專利技術而不是對本專利技術的進一步限定。實施例1稱取0.1g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.1g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸環己酯(L)加入0.3g1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環己基苯酮和0.03gN,N'-亞甲基雙丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min后，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風干，得到聚合物涂層E1K1L1。將人類脂肪干細胞按密度為1×105/mL接種于聚合物涂層上進行長期培養。收集第2代人類脂肪干細胞，將細胞濃度調整為1×105/mL，接種于聚合物涂層本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：包括以下步驟：a、蓋玻片的處理：用等離子表面清洗機對蓋玻片正反兩面進行處理，然后將處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，放置一段時間，取出，溶劑淋洗，自然風干，備用；b、聚合物涂層的制備：將單體、交聯劑、紫外光引發劑和溶劑按比例混合均勻，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將步驟a得到的蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣，紫外聚合，得到聚合物涂層；步驟b中單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環己酯L、甲基丙烯酸?2?(二乙氨基)乙酯K，聚合物涂層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數字為各單體之間的質量比。

【技術特征摘要】
1.一種用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：包括以下步驟：a、蓋玻片的處理：用等離子表面清洗機對蓋玻片正反兩面進行處理，然后將處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，放置一段時間，取出，溶劑淋洗，自然風干，備用；b、聚合物涂層的制備：將單體、交聯劑、紫外光引發劑和溶劑按比例混合均勻，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將步驟a得到的蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣，紫外聚合，得到聚合物涂層；步驟b中單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環己酯L、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯K，聚合物涂層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數字為各單體之間的質量比。2.根據權利要求1所述的用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：所述的步驟a中等離子表面清洗機功率500w，時間120s；蓋玻片的規格為φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的體積比為60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。3.根據權利要求1所述的用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：所述的步驟a中處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，在恒溫振蕩器震蕩24h后，取出蓋玻片，用丙酮清洗2～3次，自然風干，保存在-25℃冰箱中待用。4.根據權利要求1所述的用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：所述的步驟b中交聯劑為N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺，紫外光引發劑為1-羥環己基苯酮，溶劑為1-甲基-2-吡咯烷酮，單體固含量為50％，交聯劑和紫外光引發劑分別占單體總質量的10％和5％，步驟b中聚合物溶液為10μL。5.根據權利要求1所述的用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的制備方法，其特征是：所述的步驟b中聚合物涂層具體制備方法為：用365nm紫外光照射30min后，將PET薄膜剝離，得到復合有聚合物涂層的載玻片，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風干。6.權利要求1所述的用于人類脂肪干細胞體外長期培養的聚合物涂層的應用，其特征是：包括：c、人類脂肪干細胞在聚合物涂層上的長期培養：收集人類脂肪干細胞消化并計數，接種到聚合物涂層表面進行長期體外培養；d、誘導人類脂肪干細胞向成脂、成骨、成軟骨細胞的分化：待c中的人類脂肪干細胞生長至80％融合時，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導培養液，以加入L-DMEM培養基組作為陰性對照組于培養箱中培養。e、對誘導后的三種成體細胞分別進行染色定性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張嶸，邱林子，王桂容，
申請(專利權)人：常州大學，
類型：發明
國別省市：江蘇,32