一種TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條制造技術

本發明專利技術公開了一種TMV?CMV?PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條，由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述膠體金墊上包被有膠體金標記的TMV特異抗體、CMV特異抗體和PVY特異抗體，三種抗體分別由雜交瘤細胞株BALB/c?15?50、BALBc?15?27、BALBc?15?8分泌產生；所述NC膜上設置有檢測線和控制線，檢測線上包被有三種病毒的特異抗原；控制線上包被有膠體金標記的二抗。該試紙條尤其是對廣東煙區的TMV、CMV、PVY的檢測，快速、靈敏、準確、成本低、操作簡便，實現一次取樣，多病毒同時診斷，非常適合對大批量樣品進行現場初篩，在實際生產中很有應用價值，推廣應用前景好。

A TMV CMV PVY three colloidal gold test strip for rapid detection of virus

The invention discloses a TMV CMV PVY three virus colloidal gold test strip for rapid detection, a sample pad, a colloidal gold pad, NC film, absorbent filter and backing composition; the colloidal gold pad is covered by a note of TMV specific antibody and CMV specific antibody and PVY specific antibody colloidal gold label three, antibody by hybridoma cell line BALB/c 15 50, BALBc 27, BALBc 15 15 8 secreted; the NC membrane is arranged on the test line and control line, the detection line is coated with three kinds of virus specific antigen; the control line is coated with colloidal gold labeled the two anti. The test strip detection especially on tobacco in Guangdong District of TMV, CMV, PVY, fast, sensitive, accurate, low cost, simple operation, to achieve a multi sampling, and virus diagnosis, very suitable for large quantities of samples for on-site screening, it has application value in actual production, promotion and application prospects.

【技術實現步驟摘要】
一種TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條
本專利技術屬于病原物檢測
更具體地，涉及一種TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條。
技術介紹
煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)是侵染煙草的主要病毒。它們引發的病毒病每年導致煙草產業巨大的經濟損失。快速、準確地定性檢測相關病毒是生產上防控病害、減少損失的重要手段之一。在科學研究中，植物病毒的檢測方法主要有生物學檢測法(癥狀類型辨別、鑒別寄主等)、電鏡技術、血清學檢測法(酶聯免疫吸附反應(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)等)和分子生物學檢測法(包括PCR技術、核酸探針技術等)等。分離病毒照電鏡雖然是診斷病毒的有效手段，其特異性強，但非常費時費力，需要專業的技術人員，不適合推廣使用。血清學檢測方法比較費時、費力。免疫熒光、ELLSA等方法雖然具有微量、特異、快速、準確的優點，但需要比較完備的試驗儀器和經驗豐富的技術人員來操作和判斷結果，檢測一批樣品整個流程需要4～8小時，對于基層工作場所很難做到。PCR及核酸探針的診斷更需要有特殊的儀器和藥品，技術含量很高，一般只適于實驗室診斷或研究應用，很難在基層推廣。因此，迫切需要建立一種簡單、快速、靈敏、廉價并且適合于基層應用的病毒診斷方法。1971年膠體金作為標記物開始用于免疫組織化學。Faulk等應用電鏡免疫膠體金染色法觀察沙門氏菌。許多學者進一步證實膠體金能穩定迅速地吸附蛋白質，而蛋白質的生物活性無明顯改變。它可以作為探針進行細胞表面和細胞內多糖、蛋白質、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精確定位，也可以用于日常的免疫診斷，進行免疫組織化學定位。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在l～150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。免疫膠體金層析技術(Goldimmunochromatographyassay，GICA)作為一種新的免疫學檢測方法，是20世紀80年代在免疫膠體金標記技術基礎上建立起來的一種新型獨特的診斷技術。這項技術將膠體金標記技術、免疫檢測技術、層析分析技術、單(多)克隆抗體技術和新材料技術等多種方法有機結合在一起，具有簡單、快速、準確、無污染、操作簡單和無需特殊設備等優點，在醫學、動植物檢疫、食品安全監督各領域得到了日益廣泛的應用。20世紀90年代初到中期，膠體金標記免疫層析診斷技術開始進入商業化應用。利用這種技術開發的膠體金快速檢測試紙條具有操作簡便、快捷、可單份檢測、便于保存、不需特殊設備等優點，可在現場(臨床)對目標病原進行初篩，節省大量的人力、物力。在醫學領域，這種技術除用于激素、傳染病病原的抗原和抗體、細菌、寄生蟲的檢測外，還發展到了對毒品等小分子物質的檢測。檢測的標本類型也涵蓋了血清、血漿、全血、尿、糞便及唾液等，顯示出了廣闊的前景和巨大的應用價值。目前，膠體金試紙條在國內主要應用于醫學領域和畜牧獸醫領域，植物病毒方面很少見到。在農牧領域，較少有成熟的產品，更多的出現在相關的科研項目中。孫艷等(2011)應用膠體金技術進行了黃瓜細菌性角斑病(Pseudomona.s.syringaepv.Lachrymans)的快速檢測研究。國內涉及到煙草病毒病檢測的商用膠體金試紙條非常少。國外的商品化試紙條非常昂貴，價格在50～60元人民幣/張，不適于生產上大批煙苗的檢測使用。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種廣東煙區TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條。核心技術是開發針對煙草苗期主要病毒煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)的多重膠體金檢測試紙條。實現一次取樣，多病毒同時診斷，讓煙農操作方便，診斷及時準確。本專利技術的目的是提供一株可以產生TMV特異單抗的雜交瘤細胞株BALB/c-15-50，一株可以產生CMV特異單抗的雜交瘤細胞株BALBc-15-27，以及一株一株可以產生PVY特異單抗的雜交瘤細胞株BALBc-15-8。本專利技術另一目的是提供一種TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條。本專利技術的再一目的是提供所述TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條的應用。本專利技術上述目的通過以下技術方案實現：一株產生TMV的特異單抗的BALB/c小鼠雜交瘤細胞株BALB/c-15-50，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12678，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。同時，由上述雜交瘤細胞株BALB/c-15-50分泌產生的TMV特異單抗也在本專利技術的保護范圍之內。一株產生CMV的特異單抗的BALB/c小鼠雜交瘤細胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12679，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。同時，由上述雜交瘤細胞株BALBc-15-27分泌產生的CMV特異抗體也在本專利技術的保護范圍之內。一株產生PVY的特異單抗的BALB/c小鼠雜交瘤細胞株BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12677，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。同時，由上述雜交瘤細胞株BALBc-15-8分泌產生的PVY特異抗體也在本專利技術的保護范圍之內。另外，由上述TMV特異抗體、CMV特異抗體和PVY特異抗體制備的TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條，也在本專利技術的保護范圍之內。優選地，所述TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結合在NC膜的另一端；所述膠體金墊上包被有膠體金標記的TMV特異抗體、CMV特異抗體和PVY特異抗體，所述NC膜上設置有檢測線(T線)和控制線(C線)，且檢測線(T線)位于膠體金墊和控制線(C線)之間的位置；檢測線(T線)上包被有三種病毒的特異抗原；控制線(C線)上包被有膠體金標記的二抗。上述TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條在TMV、CMV和/或PVY病毒的檢測方面，具有很好的應用前景，尤其是針對廣東煙區的TMV、CMV和/或PVY病毒，檢測靈敏度可以達到1g/100mL。本專利技術利用競爭抑制法，成功構建了TMV-CMV-PVY的三重檢測試紙條。其基本原理如下：膠體金標記的TMV、CMV、PVY特異抗體吸附在結合墊(即膠體金墊)上，三種病毒的特異抗原以條帶狀固定在硝酸纖維膜的測試線(T線)處上，膠體金標記的二抗固定在硝酸纖維膜的控制線(C線)處。當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株產生TMV的特異單抗的雜交瘤細胞株BALB/c?15?50，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.12678，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

【技術特征摘要】
1.一株產生TMV的特異單抗的雜交瘤細胞株BALB/c-15-50，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12678，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。2.一株產生CMV的特異單抗的雜交瘤細胞株BALBc-15-27，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12679，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。3.一株產生PVY的特異單抗的雜交瘤細胞株BALBc-15-8，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.12677，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。4.一種TMV-CMV-PVY三重病毒膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，由樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水濾紙和背襯組成；所述樣品墊、膠體金墊和NC膜按照從左至右、從上至下的順序依次結合在背襯同一面上，膠體金墊和NC膜的端部重疊；所述吸水濾紙結合在NC膜的另一端；所述膠...

【專利技術屬性】
技術研發人員：阮小蕾，鄧海濱，王曉賓，
申請(專利權)人：華南農業大學，廣東省煙草南雄科學研究所，中國煙草總公司廣東省公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44