Sortase A介導(dǎo)的(S)-羰基還原酶寡聚體高效催化(S)-苯基乙二醇的合成制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了Sortase A介導(dǎo)的(S)?羰基還原酶寡聚體高效催化(S)?苯基乙二醇的合成，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)將引入SrtA識(shí)別序列的(S)?羰基還原酶進(jìn)行純化，同時(shí)純化得到SrtA純酶，利用SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)，得到(S)?羰基還原酶寡聚體；以分離得到的寡聚體為催化劑，2?羥基苯乙酮為底物，反應(yīng)時(shí)間3小時(shí)，產(chǎn)物(S)?苯基乙二醇光學(xué)純度達(dá)到100％e.e.，產(chǎn)率為99％；相比于原始酶，寡聚體的酶活提高了6倍，催化轉(zhuǎn)化(S)?苯基乙二醇的時(shí)間縮短了16倍，熱穩(wěn)定性提高了10℃。本發(fā)明專利技術(shù)利用SrtA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接解決了羰基還原酶催化效率低，熱穩(wěn)定性差的缺陷，為高效制備(S)?苯基乙二醇提供了有效途徑，為蛋白質(zhì)改造領(lǐng)域提供了新的方向。

Sortase mediated A (S) carbonyl reductase oligomers (S) catalyze the synthesis of ethylene glycol phenyl

The invention discloses a Sortase mediated by A (S) carbonyl reductase oligomers (S) catalyze the synthesis of ethylene glycol phenyl, belongs to the field of biocatalysis asymmetric transformation. The invention introduces the SrtA recognition sequence (S) carbonyl reductase was purified and purified SrtA pure enzyme, linked with the reaction mediated by SrtA (S), obtained carbonyl reductase oligomers; with isolated oligomers as catalyst, 2 2-hydroxyacetophenone as substrate, reaction time 3 hours, the product (S) 1-phenyl-1,2-ethanediol optical purity reaches 100%e.e., the yield was 99%; compared to the original enzyme, oligomeric enzyme activity increased by 6 times, the catalytic conversion (S) 1-phenyl-1,2-ethanediol time shortened 16 times, improve the thermal stability of 10 C. The invention solves the connection of low catalytic efficiency of carbonyl reductase by SrtA mediated protein defects, poor thermal stability, efficient preparation (S) provides an effective way for 1-phenyl-1,2-ethanediol, provides a new direction for the field of protein modification.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
SortaseA介導(dǎo)的(S)-羰基還原酶寡聚體高效催化(S)-苯基乙二醇的合成
本專利技術(shù)涉及SortaseA介導(dǎo)的(S)-羰基還原酶寡聚體高效催化(S)-苯基乙二醇的合成，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
手性化合物在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等精細(xì)化工品的生產(chǎn)上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，如光學(xué)純苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，而且是制備具有光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體。氧化還原酶是一種具有高度立體選擇性的生物催化劑，常用于生物轉(zhuǎn)化光學(xué)活性的手性化合物。在眾多的微生物氧化還原酶源中，來源于近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)CCTCCM203011的(S)-羰基還原酶SCRII催化2-羥基苯乙酮的還原反應(yīng)，產(chǎn)生(S)-苯基乙二醇。然而該酶在催化不對(duì)稱反應(yīng)時(shí)存在時(shí)間周期長，效率低的缺點(diǎn)。雖然釀酒酵母和畢赤酵母都曾用于其同工酶的表達(dá)宿主，效果仍是不佳。最近，專利技術(shù)人實(shí)現(xiàn)了該酶在近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)CCTCCM203011中進(jìn)行就地表達(dá)，并將其活性提高了2倍，產(chǎn)物光學(xué)純度和產(chǎn)率均超過99％，但整個(gè)轉(zhuǎn)化過程卻需要24小時(shí)。因此，有必要尋求利用蛋白質(zhì)工程對(duì)(S)-羰基還原酶SCRII進(jìn)行改造，獲得功能加強(qiáng)的氧化還原酶。近幾年來，蛋白質(zhì)連接在生物化學(xué)領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用，人們可以將多肽類似物，小分子探針等等特異性地添加到蛋白質(zhì)的末端，給蛋白質(zhì)賦予了特定的功能。目前常用的方法是來自金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus中的sortaseA(SrtA)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接，該方法具有溫和性、特異性、高效性等優(yōu)點(diǎn)。通過識(shí)別特定的信號(hào)序列LPXTG(X可以為任何氨基酸)，并切開蘇氨酸與甘氨酸之間的酰胺鍵，形成一個(gè)硫酯中間體，接下來由一個(gè)寡聚甘氨酸序列作為親核試劑來進(jìn)攻這個(gè)硫酯中間體，最終完成寡聚甘氨酸與蛋白質(zhì)之間的連接。如果將寡聚甘氨酸添加至熒光素、生物素等一些小分子探針上，就能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)標(biāo)記。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述問題，本專利技術(shù)已經(jīng)利用(S)-專一性羰基還原酶的重組菌株催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇，在此基礎(chǔ)上，從金黃色葡萄球菌(S.aureus)中克隆出sortaseA基因srtA，將其在大腸桿菌宿主中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)，利用基因工程技術(shù)在SCRII的C末端添加信號(hào)序列LPETG，其N末端原本存在的甘氨酸作為親核試劑，在sortaseA的介導(dǎo)下成功實(shí)現(xiàn)了SCRII寡聚化。生成的寡聚體，克服了SCRII本身的空間位阻效應(yīng)，相比于原始酶SCRII在熱穩(wěn)定性和催化效率方面均有比較大的提高，并且在3小時(shí)內(nèi)的轉(zhuǎn)化率和得率均達(dá)到了99％，相對(duì)于原始酶時(shí)間縮短了16倍。此外，專利技術(shù)人將該方法應(yīng)用于其它幾種氧化還原酶如羰基還原酶2(CR2，基因編號(hào)AB183149)、羰基還原酶4(CR4，基因編號(hào)E59061)、(S)-羰基還原酶(SCR，基因編號(hào)FJ939565)、(S)-羰基還原酶3(SCR3，基因編號(hào)FJ939564)等，酶活和熱穩(wěn)定性都有顯著提高，說明本專利技術(shù)方法有利于強(qiáng)化氧化還原酶的強(qiáng)化酶學(xué)性質(zhì)、提高催化效率。本專利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供一種氧化還原酶寡聚體，所述氧化還原酶寡聚體是先制備在C末端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶，然后使該氧化還原酶發(fā)生通過轉(zhuǎn)肽酶SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)而得到氧化還原酶寡聚體。在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在Ca2+存在的條件下進(jìn)行。在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在含有Ca2+的緩沖體系中加入轉(zhuǎn)肽酶SrtA和C末端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶，反應(yīng)一段時(shí)間即得到氧化還原酶寡聚體。在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在10℃–35℃下反應(yīng)12h–36h。在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在25℃下反應(yīng)36h。在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶寡聚體為羰基還原酶寡聚體。在一種實(shí)施方式中，所述羰基還原酶寡聚體為(S)-羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶IV寡聚體、(S)-羰基還原酶寡聚體、(S)-羰基還原酶III寡聚體。在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶為氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的(S)-羰基還原酶，或者NCBI上geneID為AB183149的CR2、geneID為E59061的CR4、geneID為FJ939565的SCR、geneID為FJ939564的SCR3等。在一種實(shí)施方式中，所述sortaseA識(shí)別序列為LPXTG(如SEQIDNO:2所示)，其中X為任意一種氨基酸。在一種實(shí)施方式中，所述sortaseA識(shí)別序列與氧化還原酶之間通過柔性連接肽連接。在一種實(shí)施方式中，所述柔性連接肽為GGGGS(如SEQIDNO:9所示)。在一種實(shí)施方式中，所述sortaseA識(shí)別序列為LPETG(如SEQIDNO:3所示)。在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)肽酶SrtA是來源于金黃色葡萄球菌的SrtA。在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)肽酶SrtA的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶寡聚體的制備，是先在氧化還原酶的C端添加sortaseA識(shí)別序列，然后分別表達(dá)并純化C端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶和轉(zhuǎn)肽酶SrtA，再在Ca+存在的條件下加入C端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶和轉(zhuǎn)肽酶SrtA，使氧化還原酶發(fā)生連接反應(yīng)，得到氧化還原酶寡聚體。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供一種重組菌，所述重組菌表達(dá)在C末端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶。在一種實(shí)施方式中，所述羰基還原酶寡聚體為(S)-羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶IV寡聚體、(S)-羰基還原酶寡聚體、(S)-羰基還原酶III寡聚體。在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶為氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的(S)-羰基還原酶II。在一種實(shí)施方式中，所述sortaseA識(shí)別序列為LPXTG，其中X為任意一種氨基酸。本專利技術(shù)的第三個(gè)目的是提供一種催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的方法，所述方法是以本專利技術(shù)的(S)-羰基還原酶寡聚體作為催化劑。在一種實(shí)施方式中，所述方法是以2-HAP為底物制備(S)-苯基乙二醇。在一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：用SCRII寡聚體轉(zhuǎn)化2-HAP；反應(yīng)體系：100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，5g/L2-HAP和等摩爾的NADPH，適量的SCRII寡聚體純酶液；反應(yīng)在35℃、200r/min的條件下反應(yīng)3h。本專利技術(shù)的第四個(gè)目的是提供所述氧化還原酶寡聚體在制備手性化合物方面的應(yīng)用。本專利技術(shù)的第五個(gè)目的是提供所述氧化還原酶寡聚體在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用。本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和效果：(1)本專利技術(shù)成功建立了一種獲得氧化還原酶寡聚體的方法，相比于原始酶，通過這種方法連接的寡聚體具有顯著提高的催化活性和熱穩(wěn)定性；用該寡聚體催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3小時(shí)，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇光學(xué)純度達(dá)到100％e.e.，產(chǎn)率為99％；相比于原始酶，寡聚體的催化效率提高了6倍，熱穩(wěn)定性提高了10℃。(2)本專利技術(shù)從S.aureus中克隆出SrtA，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高效表達(dá)，同時(shí)，通過基因工程手段在SCRII的C末端添加SrtA的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種氧化還原酶寡聚體，其特征在于，所述氧化還原酶寡聚體是先制備在C末端添加了sortase?A識(shí)別序列的氧化還原酶，然后使該氧化還原酶發(fā)生通過轉(zhuǎn)肽酶SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)而得到氧化還原酶寡聚體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種氧化還原酶寡聚體，其特征在于，所述氧化還原酶寡聚體是先制備在C末端添加了sortaseA識(shí)別序列的氧化還原酶，然后使該氧化還原酶發(fā)生通過轉(zhuǎn)肽酶SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)而得到氧化還原酶寡聚體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原酶寡聚體，其特征在于，所述氧化還原酶寡聚體為羰基還原酶寡聚體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原酶寡聚體，其特征在于，所述連接反應(yīng)是在Ca+存在的條件下進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原酶寡聚體，其特征在于，所述sortaseA識(shí)別序列為LPXTG，其中X為任意一種氨基酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張榮珍，徐巖，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇,32