制備蛋白酶的方法技術

本發明專利技術涉及一種制備蛋白酶的方法，在微生物生長的對數期至穩定期的特定時間段內，持續向培養基中加入蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑能夠有效抑制蛋白酶的自降解。并且發明專利技術人意外發現蛋白酶抑制劑在微生物生長的特定時間段內持續加入培養基中，并不會抑制發酵微生物的生長，極大的提升蛋白酶的產量。

Process for preparing protease

The invention relates to a preparation method of protease, in a specific period of time to the logarithmic phase of growth of microorganisms in the stable period, continuously added to culture medium of protease inhibitors, protease inhibitors can effectively inhibit the protease from degradation. Moreover, the inventor accidentally discovered that protease inhibitors continued to be added to the medium during a specific period of microbial growth and did not inhibit the growth of fermentation microorganisms and greatly increased protease production.

【技術實現步驟摘要】
制備蛋白酶的方法
本專利技術涉及發酵
，特別是涉及一種制備蛋白酶的方法。
技術介紹
酶制劑已經廣泛應用于食品、醫藥、輕工、化工、環境保護以及農業和能源等方面。酶制劑是指從有機生物中提取或由微生物分泌出的一類具有催化活性的物質，主要可通過深層發酵的方式利用細菌、絲狀真菌和酵母等生產酶制劑。然而，通過發酵的方法生產酶制劑的過程中，由于酶制劑容易降解，穩定性較差，導致產量較低，這點在通過發酵制備蛋白酶時尤其如此。大部分微生物來源的蛋白酶在進行大規模的工業化生產時，由于蛋白酶傾向于自降解，所以難于積累。抑制劑可以抑制蛋白酶的自降解，然而傳統的方法加入抑制劑后會極大抑制發酵微生物的生長，導致整體產量下降，所以現有的發酵生產工藝無法將其應用到提升蛋白酶產量當中。另一種方案是通過控制發酵過程的溫度提升蛋白酶產量的方法，但該方法仍不能解決蛋白酶自降解導致的發酵產量受到限制的問題。綜上，傳統的微生物發酵生產蛋白酶過程中，蛋白酶自降解導致蛋白酶的產量下降是行業迫切的需要解決的技術問題，該問題已成為制約蛋白酶工業化生產的瓶頸。
技術實現思路
基于此，有必要提供一種能夠解決蛋白酶自降解從而提升蛋白酶的產量的制備蛋白酶的方法。一種制備蛋白酶的方法，包括如下步驟：在培養基中發酵培養微生物，并在所述微生物生長的特定時間段內持續向所述培養基中加入蛋白酶抑制劑，所述特定時間段處于所述微生物生長的對數期至穩定期的時間段內；以及所述微生物分泌產生蛋白酶。在一個實施方式中，所述特定時間段持續時間為4h～48h，所述蛋白酶抑制劑在所述培養基中的終濃度為0.1g/L～5g/L，向所述培養基中加入所述蛋白酶抑制劑的速率為0.002g/(L·h)～1.25g/(L·h)。在一個實施方式中，所述蛋白酶抑制劑為硼酸衍生物。在一個實施方式中，所述蛋白酶抑制劑選自4-甲酰基苯基硼酸、N-2-吡嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸、噻吩-3-硼酸、3-乙酰氨基苯基硼酸、N-酰基-肽基硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、2-氟-5-(甲氧羰基)苯硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、2-氟-4-(甲氧羰基)苯硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、4-(1-哌啶基甲基)苯硼酸、4-(1-吡咯烷基甲基)苯硼酸、二苯并噻吩基-1-硼酸、2-(甲氧羰基)-4-甲基苯硼酸、2,6-二氯-3-甲基苯硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、2-異丙氧基苯硼酸、2-氟-4-甲砜基苯硼酸、呋喃-2-硼酸、3-氟-4-甲砜基苯硼酸、1-Boc-7-甲氧基吲哚-2-硼酸、呋喃-3-硼酸、4-(1-哌啶基磺酰基)苯硼酸、3-乙酰氨基苯硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、2-甲基-4-甲氧基苯硼酸、5-甲基-3-吡啶硼酸、5-正丙基噻-2-硼酸、10-苯基-9-蒽硼酸、3-溴噻吩硼酸、5-甲基-6-氟-3-吡啶硼酸、3-溴噻吩-4-硼酸、2,6-二氟-3-吡啶硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、3-氯-4-甲氧羰基苯硼酸、苯硼酸、2-氯-4-甲氧基苯硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、3-甲基-4-氯苯硼酸、二苯代硼酸、4-(環丙基氨磺酰基)苯硼酸和5-甲基氧呋喃-2-硼酸中的至少一種。在一個實施方式中，還包括在所述微生物生長的特定時間段內持續向所述培養基中加入蛋白酶穩定劑。在一個實施方式中，所述蛋白酶穩定劑選自鎂離子和鈣離子中的至少一種。在一個實施方式中，所述特定時間段持續時間為4h～48h，所述鎂離子和所述鈣離子中的至少一種在所述培養基中的終濃度為0.005mol/L～0.1mol/L。在一個實施方式中，所述微生物為枯草芽胞桿菌，在培養基中發酵培養所述枯草芽胞桿菌35h～40h后開始向所述培養基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的時間段內持續的加入至所述培養基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培養基中的終濃度為0.2g/L～0.6g/L，向所述培養基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率為0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。在一個實施方式中，還包括在所述微生物生長的特定時間段內持續向所述培養基中加入蛋白酶穩定劑，所述蛋白酶穩定劑選自鎂離子和鈣離子中的至少一種，所述鎂離子和所述鈣離子中的至少一種在所述培養基中的終濃度為0.0125mol/L～0.025mol/L。在一個實施方式中，所述微生物為畢赤酵母，在培養基中發酵培養所述畢赤酵母30h～40h后開始向所述培養基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的時間段內持續的加入至所述培養基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培養基中的終濃度為0.2g/L～0.6g/L，向所述培養基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率為0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。上述制備蛋白酶的方法，在微生物生長的對數期至穩定期的特定時間段內，持續向培養基中加入蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑能夠有效抑制蛋白酶的自降解。并且專利技術人意外發現蛋白酶抑制劑在微生物生長的特定時間段內持續加入培養基中，并不會抑制發酵微生物的生長，極大的提升蛋白酶的產量。另外，在微生物生長的特定時間段內持續向培養基中加入蛋白酶穩定劑，蛋白酶抑制劑與蛋白酶穩定劑配合，能夠進一步的提升蛋白酶的產量。附圖說明圖1為一實施方式的制備蛋白酶的方法的流程圖；圖2為實施例1中枯草芽胞桿菌SCK6的生長曲線示意圖；圖3為實施例1中畢赤酵母GS115的生長曲線示意圖。具體實施方式為使本專利技術的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施例對本專利技術的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本專利技術。但是本專利技術能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本專利技術內涵的情況下做類似改進，因此本專利技術不受下面公開的具體實施的限制。請參閱圖1，一實施方式的制備蛋白酶的方法包括如下步驟S110～S120。S110、在培養基中發酵培養微生物，并在微生物生長的特定時間段內持續向培養基中加入蛋白酶抑制劑，特定時間段處于微生物生長的對數期至穩定期的時間段內。具體的，本專利技術用來發酵培養微生物的培養基是指任何適合微生物生長的常規培養基，包括基本培養基和復合培養基。培養基的獲得可以通過從商業供應商購買，或參考中國普通微生物菌種保藏中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，中國典型培養物保藏中心(ChinaCentreforTypeCultureCollection,CCTCC)，美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)，德國微生物與細胞培養物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,DSMZ)等機構公布的制作方法，利用本領域已知的方法制備。本專利技術的制備蛋白酶的方法可以在任何規模的蛋白酶工業發酵生產中使用，例如，可用于規模達到10L、100L、1000L、10000L、甚至100000L的發酵設備的生產。發酵培養的工藝可以采用批次、重復批次、補料批次和連續補料的發酵方法。在一個實施方案中，微生物采用枯草芽孢桿菌的發酵采用的是批次發酵的方法。在另一個實施方案中，微生本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：在培養基中發酵培養微生物，并在所述微生物生長的特定時間段內持續向所述培養基中加入蛋白酶抑制劑，所述特定時間段處于所述微生物生長的對數期至穩定期的時間段內；以及所述微生物分泌產生蛋白酶。

【技術特征摘要】
1.一種制備蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：在培養基中發酵培養微生物，并在所述微生物生長的特定時間段內持續向所述培養基中加入蛋白酶抑制劑，所述特定時間段處于所述微生物生長的對數期至穩定期的時間段內；以及所述微生物分泌產生蛋白酶。2.根據權利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述特定時間段持續時間為4h～48h，所述蛋白酶抑制劑在所述培養基中的終濃度為0.1g/L～5g/L，向所述培養基中加入所述蛋白酶抑制劑的速率為0.002g/(L·h)～1.25g/(L·h)。3.根據權利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑為硼酸衍生物。4.根據權利要求1或3所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑選自4-甲酰基苯基硼酸、N-2-吡嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸、噻吩-3-硼酸、3-乙酰氨基苯基硼酸、N-酰基-肽基硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、2-氟-5-(甲氧羰基)苯硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、2-氟-4-(甲氧羰基)苯硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、4-(1-哌啶基甲基)苯硼酸、4-(1-吡咯烷基甲基)苯硼酸、二苯并噻吩基-1-硼酸、2-(甲氧羰基)-4-甲基苯硼酸、2,6-二氯-3-甲基苯硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、2-異丙氧基苯硼酸、2-氟-4-甲砜基苯硼酸、呋喃-2-硼酸、3-氟-4-甲砜基苯硼酸、1-Boc-7-甲氧基吲哚-2-硼酸、呋喃-3-硼酸、4-(1-哌啶基磺酰基)苯硼酸、3-乙酰氨基苯硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、2-甲基-4-甲氧基苯硼酸、5-甲基-3-吡啶硼酸、5-正丙基噻-2-硼酸、10-苯基-9-蒽硼酸、3-溴噻吩硼酸、5-甲基-6-氟-3-吡啶硼酸、3-溴噻吩-4-硼酸、2,6-二氟-3-吡啶硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、3-氯-4-甲氧羰基苯硼酸、苯硼酸、2-氯-4-甲氧基苯硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、3-甲基-4-氯苯硼...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王俊，張利萍，馮甲，
申請(專利權)人：廣州立白企業集團有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44