腈水解酶突變體及其編碼基因和應用制造技術

本發(fā)明專利技術涉及一種腈水解酶突變體，特別涉及一種腈水解酶突變體及其編碼基因，以及其在制備光學活性2?芳基丙酸中的應用。所述突變體包含SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120。該突變體與野生型腈水解酶相比具有更高的酶活和/或立體選擇性，該腈水解酶突變體在制備光學活性2?APA中的應用，較化學合成法，能夠降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，適應工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

Nitrile hydrolase mutants and coding genes and uses thereof

The invention relates to a nitrilase mutant, in particular to a nitrilase mutant and its encoding gene, and its application in the preparation of optically active aryl propionic acid in 2. The mutant SEQ ID NO:1 contains shown the amino acid sequence of any one or more of the amino acid sites of amino acid substitutions, the loci were 135, 41, 192, 120. Compared to the mutant and the wild type nitrilase has higher enzyme activity and / or stereo selective application of the nitrilase mutant in the preparation of optically active 2 APA, compared with chemical synthesis, reduce production cost, improve production efficiency and meet the requirements of industrial production.

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
腈水解酶突變體及其編碼基因和應用
本專利技術涉及一種腈水解酶突變體，特別涉及一種腈水解酶突變體及其編碼基因，以及其在制備光學活性2-芳基丙酸中的應用。
技術介紹
在有機合成中，氰基易作為“水穩(wěn)定負碳離子”引入有機化合物，而腈類化合物則是一種多用途的中間體，能轉化為胺、酰胺、羧酸和羧基化合物等。用微生物酶水解腈為酰胺和羧酸時，由于反應條件溫和以及高純度的產(chǎn)物使之成為一種備受關注的方法，迄今在工業(yè)生產(chǎn)上已有許多成功的例子。近年來，頗有意義的是研究用微生物酶立體選擇性水解腈類制備光學活性2-芳基丙酸(2-APA)，光學活性2-APA可作為藥物活性基質，特別是作為非甾體抗炎藥(NSAID)應用。由于藥理臨床的研究表明2-APA類的NSAID的對映體中只有右旋的構型顯示高的藥理活性，左旋構型活性低或無作用。鑒于一般化學反應所產(chǎn)生的手性中心總是得到等量的一對對映體混合物，稱之為外消旋體。欲得到光學純右旋2-APA，拆分外消旋體是主要方法之一。一般來說采用化學拆分需用手性衍生試劑，價格昂貴，且過程冗長，較難得到滿意的結果。而用微生物酶法拆分則可提供一個經(jīng)濟的選擇。酮洛芬(Ketoprofen，KP)又名酮基布洛芬、苯酮苯丙酸、優(yōu)布芬、優(yōu)洛芬或Profenid，化學名為α-甲基-3-苯甲酰基苯乙酸，是由法國化學家Farge、Messer和Moutounier于1967年開發(fā)的優(yōu)良的2-芳基丙酸類非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物。其作用機制主要是通過抑制體內(nèi)環(huán)氧合酶(COXs)、脂氧化酶(LOXs)的生物活性，從而抑制致炎物質前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)的合成，具有對抗緩激肽釋放、清除羥自由基以及穩(wěn)定溶酶體膜活性，從而產(chǎn)生良好的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，并增強其外周止痛效果。臨床研究表明，酮洛芬作為重要的非甾體抗炎藥物，與同類藥物相比，具有劑量小、療效高、耐受性好和毒副作用輕微等顯著優(yōu)點，成為治療類風濕性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強硬性脊椎炎以及痛風的理想藥物，廣泛適用于治療痛經(jīng)、牙痛、術后疼痛、癌性疼痛和神經(jīng)炎、紅斑狼瘡、咽喉及支氣管炎等疾病，對軟組織受傷的治療效果更好。酮洛芬是2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs)，只有右旋體才具有抗炎抗風濕和鎮(zhèn)痛作用，左旋體幾乎沒有藥理活性。酮洛芬的主要生產(chǎn)企業(yè)，國外除法國Rhone-Poulenc公司外，還有德國Sanofi-Aventis、意大利SIMS、Cosma和BidaChem、印度BECChemicals等公司；國內(nèi)西南合成制藥股份有限公司(原西南合成制藥廠)、中國科學院上海藥物研究所實驗藥廠較早開展了酮洛芬的產(chǎn)品研制和工藝開發(fā)工作。目前化學合成酮洛芬的工藝路線已非常成熟，但是合成的酮洛芬缺乏手型選擇性。由于左旋酮洛芬沒有藥理活性，并且有很大副作用。因此，直接合成右旋酮洛芬或者將左旋酮洛芬轉變成右旋酮洛芬都具有巨大的經(jīng)濟效益。定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點突變技術是當前生物、醫(yī)學各領域研究中的一種重要實驗手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，是探索啟動子調節(jié)位點的有效手段，也是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具。定點突變改造糞產(chǎn)堿菌腈水解酶的研究具有極佳的理論和應用價值。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是通過定點突變的方法對糞產(chǎn)堿菌腈水解酶基因進行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活和手性選擇性方面有所提高，使其符合在催化生產(chǎn)右旋2-芳基丙酸工業(yè)化應用的需求。本專利技術采用的技術方案是：本專利技術提供一種腈水解酶突變體，所述突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120；其中，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔坏?1位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔坏?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷＿€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、134、120、82、192、319。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?34位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼幔?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第319位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷＿€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120。優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷＿€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、82、192、120、319，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼幔?19位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼帷＿€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、192、120，優(yōu)選的第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸，第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷８鼉?yōu)選地，在一些實施例中，所述腈水解酶突變體，包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中選自以下氨基酸突變組成的組：1)V135A+D41A；2)V135A+K120I；3)V135A+L192V；4)H134V+V135A；5)H134V+V135A+L192V；6)H134V+V135A+L192V+D41A；7)H134V+V135A+L192V+K120I。本專利技術還涉及一種多核苷酸，其編碼以上所述的腈水解酶突變體。本專利技術還涉及一種包含上述多核苷酸的重組載體。本專利技術還提供一種由所述重組載體轉化制備的重組基因工程菌。此外，本專利技術還提供一種所述腈水解酶突變體在制備光學活性2-APA中的應用。本專利技術通過定點突變的方式提供了一種腈水解酶突變體，該突變體與野生型腈水解酶相比具有更高的酶活和/或立體選擇性，該腈水解酶突變體在制備光學活性2-APA中的應用，較化學合成法，能夠降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，適應工業(yè)化生產(chǎn)的需求。附圖說明附圖1實施例1野生型腈水解酶瓊脂糖凝膠電泳圖；附圖2實施例5腈本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
根據(jù)權利要求1所述的腈水解酶突變體，其特征在于，所述突變體包含SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120，其中，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔坏?1位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔坏?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?

【技術特征摘要】
1.根據(jù)權利要求1所述的腈水解酶突變體，其特征在于，所述突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為135、41、192、120，其中，第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔坏?1位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔坏?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?.根據(jù)權利要求1所述的腈水解酶突變體，其特征在于，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔€包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點選自41、134、120、82、192、319，其中，第41位的天冬氨酸被突變?yōu)楸彼幔坏?34位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第120位的賴氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼幔坏?2位的丙氨酸被突變?yōu)樯彼幔坏?92位亮氨酸被突變?yōu)槔i氨酸；第319位的絲氨酸被突變?yōu)楫惲涟彼帷?.根據(jù)權利要求1所述的腈水解酶突變體，其特征在于，所述腈水解酶突變體包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列中第135位的纈氨酸被突變?yōu)楸彼峄蚶野彼幔€包含第134位的組氨酸被突變?yōu)槔i氨酸。4.根據(jù)權利要求3所述的腈水解酶突變體，其特征在于，還包含下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：汪璞，王小龍，林潔，鮑素敏，謝文平，張鴻，趙裕棟，吳波，張向陽，盧元東，汪寅華，李文輝，何志祥，
申請(專利權)人：東莞東陽光藥物研發(fā)有限公司，黃石世星藥業(yè)有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44