一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法技術

本發明專利技術屬于菊花栽培技術領域，具體涉及一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法。該方法包括構建RNAi表達載體、制備浸染用農桿菌菌液、對菊花愈傷組織進行浸染、對轉基因菊花幼苗進行篩選、鑒定、培養等步驟。本申請所采用構建菊花新品種的方法，對于菊花基因組沒有大的影響，不會改變菊花花型、花色等特性，但可較好調節菊花開放時間，可使菊花提前6~8天開花，表現出較好的應用效果；同時由于這一表觀遺傳修飾可以穩定遺傳，借助成熟的組培體系，可使提前開花的菊花新品種穩定、快速繁殖，從而節約大量的人力、物力成本。總之，本申請在菊花花期的調控中表現出較好的、較為穩定的調控效果，表現出較好的理論和應用價值。

Method for regulating flowering time of Chrysanthemum by using RNAi vector

The invention belongs to the technical field of chrysanthemum cultivation, in particular to a method for regulating the flowering time of Chrysanthemum by means of a RNAi vector. The method comprises the following steps: constructing RNAi expression vector, preparing Agrobacterium tumefaciens infected liquid, dipping chrysanthemum callus, screening, identifying and culturing transgenic chrysanthemum seedlings. The construction method of new varieties of chrysanthemum used for this application, the chrysanthemum genome does not have a big impact, will not change the chrysanthemum flower type, color and other characteristics, but can adjust the opening time of the chrysanthemum, chrysanthemum flower 6~8 days in advance, showing good application effect; at the same time as a result of this epigenetic modification can be inherited. With the help of mature tissue culture system, can make the flowering of chrysanthemum of new varieties of stable and rapid propagation, thus saving a lot of manpower and material costs. In conclusion, this application showed better and more stable control effect in the regulation of chrysanthemum florescence, and showed good theoretical and practical value.

【技術實現步驟摘要】
一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法
本專利技術屬于菊花栽培
，具體涉及一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法。
技術介紹
菊花是一種比較常見的觀賞花卉，具有花色多樣、花型各異以及花期長等特點，是花卉產業中極具經濟價值的花卉品種。栽培過程中，由于各地大型節假日活動的繁盛、菊花節的開展，為適應不同地域、不同時間段花展布置的需要，亟需培育一些能夠在節假日期間開花的中花品種、晚花品種等早花系菊花。因此，對于菊花花期進行調控具有十分重要的應用意義。植物從營養生長向生殖生長的轉化過程稱為“成花轉變”，這個過程的關鍵是成花誘導。植物成花誘導過程由自身遺傳物質和外界環境因素兩方面決定。外界環境的調控途徑有很多，傳統菊花花期調控技術中主要是利用菊花花芽分化對光照時間和強度的要求，通過遮光或補光處理，人為制造短日照環境，促使菊花提前開花；此外，人們也會根據栽培經驗計算好播種、扦插、修剪、打頂的時間，利用摘心、修剪、摘蕾、剝芽摘葉、環割等措施達到花期調控的目的。這兩種方法都需要經驗豐富的專業技術人才，過程繁瑣，而且每年都要根據實際情況進行處理，極大的損耗人力資源。中國專利CN200810049322公開了一種調控菊花花期的方法，該方法用5-氮雜胞嘧啶核苷處理菊花組織培養的試管苗，然后移栽，使菊花提前開花。但是這種處理方式仍然容易受具體生長環境、栽培條件等方式制約，容易發生逆轉，存在效果不夠穩定缺陷，加上這種處理方式并不能形成能夠穩定遺傳的菊花品種，每年均需處理，因而生產中應用較為有限。因此，培育新的能能夠提前開花的菊花品系仍然是現有菊花培育中的重點工作。專利技術內容本專利技術目的在于提供一種利用RNAi干涉技術來調節菊花開放時間的方法，該方法通過構建特定的RNAi載體，利用所構建的特定RNAi載體來調節菊花組織體內MET1基因表達水平，進而促進菊花的提前開放。本申請的技術方案詳述如下。一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法，該方法包括如下步驟：（1）根據菊花DNA甲基轉移酶MET1基因的全長cDNA序列中的保守序列，構建RNAi表達載體，具體為：參考《菊花與青蒿MET1基因克隆及菊花RNAi載體構建》（施冬青，2014年河南大學碩士論文）中方法，利用3’和5’RACE技術獲得菊花甲基轉移酶MET1基因全長cDNA序列，然后針對菊花MET1基因全長cDNA序列中的保守片段序列構建多個RNAi表達載體；所構建的RNAi表達載體，由于以菊花MET1基因中的保守序列（100-300bp）作為目的片段，因此當菊花MET1基因與RNAi表達載體配對結合時，可使相應配對部分的堿基形成發夾結構，形成雙鏈siRNA，對目標基因MET1的mRNA起降解作用，從而促使MET1基因的失活，使其無法正常表達；所述保守片段序列包括3個部分：Chry1、Chry3、Chry4；其中Chry1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，即：Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；Chry3的堿基序列如SEQIDNO.2所示，即：Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；Chry4的堿基序列如SEQIDNO.3所示，即：Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG；對上述特定保守區段進行PCR擴增時，特異性引物序列設計如下：PCR克隆擴增保守序列Chry1時，引物序列設計如下：FADi1-XbalⅠ:GCTCTAGACCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA，FADi1-XhoⅠ:CCGCTCGAGCCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA；FADi1-HindⅢ:CCCAAGCTTCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA，FADi1-KpnⅠ:GGGGTACCCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA；PCR克隆擴增保守序列Chry3時，引物序列設計如下：Chry3-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGAAGGGGTAATGACGGCAG，Chry3-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAGGCCATATCTGTTC；Chry3-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGAGGGGTAATGACGGCA，Chry3-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAGGCCATATCTGTTCG；PCR克隆擴增保守序列Chry4時，引物序列設計如下：Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGACAGAAGACAATGAGCAG，Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAACCCAACTGATGT；Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGCAGAAGACAATGAGC，Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAACCCAACTGATGTC；所述多個RNAi表達載體具體有：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX；（2）將步驟（1）中所構建RNAi表達載體轉化農桿菌，具體為：利用凍融法，將步驟（1）中所構建的多個RNAi表達載體分別轉入農桿菌GV3101，并篩選、保留轉化正確的菌株，并制備浸染液備用；詳細步驟為：將0.5~1μL的RNAi表達載體（大約0.5~1μg）加入到100μL的GV3101農桿菌感受態菌液中，冰浴30min，再液氮中冷凍1.5min，再立即置于37℃水浴中5min；加入1000μL的YEB液體培養基，148rpm、28℃、避光培養3h；培養結束后，5000rpm離心5min，保留約200μL上清（其余棄掉），用移液槍將沉淀吹本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：（1）根據菊花甲基轉移酶MET1基因的全長cDNA序列中的保守序列，構建RNAi表達載體，具體為：利用3’和5’RACE技術獲得菊花甲基轉移酶MET1基因全長cDNA序列，然后針對菊花MET1基因全長cDNA序列中的保守片段序列構建RNAi表達載體；所述保守片段序列包括3個部分：Chry1、Chry3、Chry4；其中Chry1的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示，即：Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；Chry3的堿基序列如SEQ?ID?NO.2所示，即：Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；Chry4的堿基序列如SEQ?ID?NO.3所示，即：Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG；所述RNAi表達載體具體為：Dhpart27RNAiFADP1P4?Chry1?KX?HX、Dhpart27RNAiFADP1P4?Chry3?KX?HX和Dhpart27RNAiFADP1P4?Chry4?KX?HX；（2）將步驟（1）中所構建RNAi表達載體轉化農桿菌，制備浸染用農桿菌菌液；（3）制備菊花愈傷組織，并利用步驟（2）中所制備浸染液對菊花愈傷組織進行浸染，并培育形成幼苗；（4）對步驟（3）中轉基因菊花幼苗進行篩選、鑒定，確保為正確的轉基因植株后，移栽到大田，正常管理。...

【技術特征摘要】
1.一種利用RNAi載體調節菊花開花時間的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：（1）根據菊花甲基轉移酶MET1基因的全長cDNA序列中的保守序列，構建RNAi表達載體，具體為：利用3’和5’RACE技術獲得菊花甲基轉移酶MET1基因全長cDNA序列，然后針對菊花MET1基因全長cDNA序列中的保守片段序列構建RNAi表達載體；所述保守片段序列包括3個部分：Chry1、Chry3、Chry4；其中Chry1的堿基序列如SEQIDNO.1所示，即：Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；Chry3的堿基序列如SEQIDNO.2所示，即：Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；Chry4的堿基序列如SEQIDNO.3所示，即：Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGA...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王子成，李忠愛，李飛，李帥磊，李茫茫，劉艷華，范曉萱，
申請(專利權)人：河南大學，
類型：發明
國別省市：河南,41