本發明專利技術公開了一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，以2’,6’?二氯?3’?氟苯乙酮為底物，磷酸緩沖液為反應介質，加入羰基還原酶、輔因子及氫供體形成生物催化反應體系，發生生物催化反應生成(S)?2’,6’?二氯?3’?氟苯乙醇。本發明專利技術采用新型的羰基還原酶催化還原反應，具有生物催化劑使用量小、反應條件溫和、反應時間短、收率高和光學純度好等優勢。
A reduction method for preparation of crizotinib using carbonyl intermediates
The invention discloses a method for preparing reductive crizotinib intermediates using carbonyl, 2 ', 6' 3 'two chlorine fluoroacetophenone as substrate, phosphate buffer solution as reaction medium, addition of carbonyl reductase, cofactor and hydrogen donor form biological catalysis system, generating biological catalysis the reaction of (S) 2', 6 '3' two chlorine - ethanol. The invention adopts a new carbonyl reductase catalytic reduction reaction, and has the advantages of small amount of biological catalyst, mild reaction condition, short reaction time, high yield and good optical purity.
【技術實現步驟摘要】
一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法
本專利技術涉及生物制藥
，特別涉及一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法。
技術介紹
賽可瑞(Xalkori，克唑替尼)是由輝瑞公司研制的抑制Met/ALK/ROS的ATP競爭性的多靶點蛋白激酶抑制劑。分別在ALK、ROS和MET激酶活性異常的腫瘤患者中證實克唑替尼對人體有顯著臨床療效。Xalkori是腫瘤藥物研發史上最快速的藥物之一，2011年在美國上市后引起轟動。克唑替尼的化學結構式如下：(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇是克唑替尼化學合成過程中一個重要的中間體。但目前主要以化學合成為主，但該方法步驟繁瑣，產品收率低，污染大，不適于規模化生產(US7858643B2)。目前(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇的生物制備方法，在催化過程中需要使用昂貴的輔酶NADP和使用葡萄糖脫氫酶進行輔酶再生，不利于該中間體的廉價制備。
技術實現思路
本專利技術的目的在于解決現有技術存在的上述不足，提供一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，方法簡單易行，產品收率高，生產成本低、環保，從而滿足克唑替尼的大規模工業化生產要求。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是：一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，以2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮為底物，磷酸緩沖液為反應介質，加入羰基還原酶、輔因子及氫供體形成生物催化反應體系，發生生物催化反應生成(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇。作為優選，所述羰基還原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述羰基還原酶的編碼基因如SEQIDNO.2所示。作為優選，所述輔因子為NAD+。作為優選，所述氫供體為異丙醇。作為優選，每升生物催化反應體系中2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮的用量為50-100g。作為優選，每升生物催化反應體系中羰基還原酶的用量為3-10g。作為優選，每升生物催化反應體系中輔因子的用量為0.05-0.1g。作為優選，每升生物催化反應體系中氫供體的用量為50-100mL。作為優選，所述磷酸緩沖液的pH為6.5-7.5。作為優選，所述生物催化反應的溫度為25-35℃，反應時間8-12h。本專利技術的有益效果是：本專利技術采用新型的羰基還原酶催化還原反應，具有生物催化劑使用量小、反應條件溫和、反應時間短、收率高、光學純度好等優勢。與現有技術的化學法相比，經濟性高、污染小，具有重要的工業應用價值。附圖說明圖1是本專利技術構建的重組羰基還原酶的表達質粒pET26-CM3；圖2是大腸桿菌BL21(DE3)/pET26-CM3誘導表達后重組羰基還原酶的SDS-PAGE電泳圖；其中M是蛋白分子量標準品，1號是破碎后上清液，2號是純化后的重組羰基還原酶。圖3是反應過程中底物和產物HPLC液相圖。(A)反應0h的液相圖；(B)反應6h后的液相圖。具體實施方式下面通過具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的具體說明。本專利技術中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。本專利技術的工藝路線如下：實施例1：(1)羰基還原酶編碼基因的合成：根據羰基還原酶CM3的原始基因序列(genebankSequenceID:ABB91667.1)，按照大腸桿菌密碼子分析用表對原始基因序列進行密碼子優化并進行目的基因的全合成，基因合成委托上海捷瑞生物科技有限公司進行，獲得的編碼基因序列如SEQIDNO.2所示，翻譯后的羰基還原酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。合成后的編碼基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達載體pET26b-CM3(見圖1)。(2)羰基還原酶的表達：制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，將重組表達載體pET26b-CM3通過熱激轉化法轉到表達菌株BL21(DE3)中并涂布到含有50μg/mL的LB平板上(10g/L蛋白胨,0.5g/L酵母粉,10g/L氯化鈉,20g/L瓊脂,pH7.0)，37℃過夜培養。次日，挑取單菌落，將單菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培養液中，37℃，振蕩培養過夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mLTB培養基中(12g/L蛋白胨,24g/L酵母粉,4mL/L甘油,0.1M磷酸緩沖液,pH7.0)，37℃下振蕩培養至OD600至3.0，然后添加IPTG至終濃度為0.1mM，25℃下誘導培養過夜。圖2說明重組羰基還原酶在大腸桿菌中獲得了正確表達。(3)細胞破碎：5000g離心10min后收集菌體，用0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)緩沖液重懸菌體，超聲破碎后所得液體即為粗酶液。(4)生物催化反應：將5g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有85mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的250mL反應器中，隨后，將15mL含有5mL異丙醇，10mgNAD+，500mg羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應器中。在30℃下磁力攪拌反應，并用堿調節反應的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測底物的消耗及產物的生成情況。HPLC檢測底物完全消耗(約8-10小時)，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相萃取。無水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99,收率為90.5％。圖3說明利用該重組羰基還原酶可以催化底物生成產物，6h后產物峰明顯增大，底物峰減小。(5)產物鑒定：利用核磁共振1HNMR對目標產物進行鑒定，(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇核磁數據1HNMR(400MHz,chloroform-D)δppm1.65(d,J＝6.8Hz,3H)5.58(q,J＝6.9Hz,1H)6.96-7.10(m,1H)7.22-7.36(m,1H)。實施例2：本實施例與實施例不同之處在于步驟(4)：將100g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的2.5L反應器中，隨后，將150mL含有100mL異丙醇，50mgNAD+，10g羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應器中。在30℃下磁力攪拌反應，并用堿調節反應的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測底物的消耗及產物的生成情況。HPLC檢測底物完全消耗，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相萃取。無水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99，產品收率為89.5％。實施例3：本實施例與實施例不同之處在于步驟(4)：將80g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的2.5L反應器中，隨后，將150mL含有70mL異丙醇，80mgNAD+，3g羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應器中。在30℃下磁力攪拌反應，并用堿調節反應的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測底物的消耗及產物的生成情況。HPLC檢測底物完全消耗，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相萃取。無水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99，產品收率為88.6％。以上所述的實施例只是本專利技術的一種較佳的方案本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，其特征在于，以2’,6’?二氯?3’?氟苯乙酮為底物，磷酸緩沖液為反應介質，加入羰基還原酶、輔因子及氫供體形成生物催化反應體系，發生生物催化反應生成(S)?2’,6’?二氯?3’?氟苯乙醇。
【技術特征摘要】
1.一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，其特征在于，以2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮為底物，磷酸緩沖液為反應介質，加入羰基還原酶、輔因子及氫供體形成生物催化反應體系，發生生物催化反應生成(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基還原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述羰基還原酶的編碼基因如SEQIDNO.2所示。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述輔因子為NAD+。4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氫供體為異丙醇。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，每...
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐云平，丁國芳，余方苗，楊最素，黃芳芳，
申請(專利權)人：浙江海洋大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33
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