黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法及其應用。以待測黃牛全基因組DNA為模板，通過四引物擴增受阻突變體系PCR擴增長鏈非編碼RNA?ADNCR基因片段，再進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果鑒定長鏈非編碼RNA?ADNCR基因在g.1263T>A位點存在不同的基因型。結果發現，長鏈非編碼RNA?ADNCR基因g.1263T>A的單核苷酸不同類型與秦川牛的坐骨端寬性狀之間存在顯著相關，提示長鏈非編碼RNA?ADNCR基因單核苷酸多態不同類型可作為提高黃牛生長發育性狀的DNA標記，有利于快速建立生長發育性狀優良的黃牛遺傳資源群體。

Single nucleotide polymorphism of ADNCR gene in cattle with four primer amplification, blocked mutation system, PCR detection method and its application

The invention discloses a four primer amplification blocked mutation system for cattle ADNCR gene single nucleotide polymorphism, a PCR detection method and an application thereof. With the test of cattle whole genome DNA as the template, through four primer amplification refractory mutation system PCR amplification of RNA encoding non chain ADNCR gene fragment, then agarose gel electrophoresis according to the electrophoresis results, identification of long chain non encoding RNA ADNCR gene in g.1263T> A locus had different genotypes. The results showed that long chain non RNA ADNCR encoding gene g.1263T> there is a significant correlation between A SNPs and different types of Qinchuan cattle hucklebone width characters, suggesting that long chain non encoding RNA single nucleotide polymorphism of ADNCR gene in different types of DNA can be used as a marker to improve the growth and development traits in cattle, conducive to the rapid establishment of excellent genetic traits in cattle population growth.

【技術實現步驟摘要】
黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法及其應用
本專利技術屬于現代生物技術與家畜育種領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛長鏈非編碼RNAADNCR基因T>A的單核苷酸多態性(SNP)的四引物擴增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)方法。
技術介紹
動物育種技術主要包括以表型和表型值為基礎的常規育種技術和以DNA多態為基礎的分子育種技術。作為分子育種技術體系的重要組成部分，分子標記輔助選擇(marker-assistedselection，MAS)育種技術首先檢測重要基因的DNA多態性，然后分析DNA多態與遺傳性狀之間的相關性，最后再根據與遺傳性狀顯著相關的DNA標記進行性狀選擇。作為現代分子生物學技術發展過程中孕育而生的新技術，MAS育種技術可以在DNA水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，該方法通過有性雜交將目的基因轉移到需要改良的親本中，將目標基因型的鑒定與傳統育種相結合，從而實現對基因型的直接選擇，提高育種目標的定向性。該方法在克服表型鑒定的困難、早期選擇、進行無損害的性狀評價和選擇及提高回交育種效率等方面具有優越性。在MAS育種技術體系中，尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點，并分析重要功能基因遺傳變異位點與生長性能的相關性，是分子標記輔助選擇技術應用的前提和關鍵。作為分子遺傳標記的重要方式之一。單核苷酸多態性(SNP)指序列間單堿基替換或插入缺失，且在群體中的發生頻率大于1％的多態類型(KwokandGu1999)。根據其在基因組中的位置可以劃分為外顯子多態性(包括錯義突變、同義突變和無義突變)、基因間區多態性、內含子或3’-/5’-調控區多態性。SNP作為一種遺傳標記，具有發生頻率高、能穩定遺傳、易進行自動化檢測等優點，并且在不同物種、不同品種間SNP分布都存在差異，所以SNP可以作為評價群體遺傳多樣性的重要指標。目前，在遺傳多樣性研究中，雜合度是常用的一種變量，這種情況下，雜合度是指在基因組上檢測到的所有SNP標記在不同樣本間的差異程度(Purcelletal.2007)。發現并且充分利用個體間基因變異對家畜育種而言是非常重要的。近幾年來，通過在家畜上已經定位出了很多與重要經濟性狀相關的位點。Fan等檢測820個商品豬的全基因組SNP，并且對背膘厚、眼肌面積等性狀進行分析，發現了與上述性狀相關的候選基因，如MC4R、BMP2等(Fanetal.2011)。Jiang等通過對2093頭中國荷斯坦奶牛的產奶性狀進行研究，共檢測出了105個與產奶性狀顯著相關的SNP標記位點(Jiangetal.2010)。此外，很多影響牛數量性狀(包括體尺、繁殖力、產奶量、壽命、難產率等)的SNP位點及其候選基因逐漸被定位出來。SNP作為一種標記輔助選擇(Marker-assistedselection)在家畜育種中具有重要的應用價值。迄今為止，檢測SNPs的技術非常多，包括限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)、單構鏈多態性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特異性PCR(AC-PCR)、直接測序法、新型高通量SNP檢測技術和引入突變位點的PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在這些技術中，PCR-RFLP法是最早應用于分子人類學的SNP檢測技術，因為該技術簡單且易操作，對于檢測單拷貝上(線粒體和Y染色體)的SNP，準確度非常高，但由于PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位點的限制，故在實際應用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技術簡便、快速、靈敏，但最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序，且電泳條件要求較嚴格，故多用于DNA研究中的未知基因突變的檢測和臨床實驗；直接測序法是最為準確的SNP檢測方法，但其檢測費用極其昂貴，且需要有測序儀等大型儀器，還需要非常熟練的技術人員和經驗，故對于在一段很短的序列上存在多個SNP的檢測是有優勢的，但不適用于生產實際；新型高通量SNP檢測技術，如SNP芯片、GWAS和第二代測序等對于樣本量較小的實驗研究，成本過高，在生產實際中應用較為局限；四引物擴增受阻突變體系PCR(T-ARMS-PCR)方法是一種新型的SNP檢測方法，該方法只需要設計特定的引物，兩個反應就能得到一個SNP位點的分型，能針對特定的基因位點，且四引物擴增受阻突變體系PCR不需要酶切，因此既減少了試驗費用，又縮短了時間。總之，四引物擴增受阻突變體系PCR方法，不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且對所檢測的序列位點無特殊性要求，因此，四引物擴增受阻突變體系PCR方法受到育種工作中的青睞，在動物分子育種的MAS體系中具有廣闊應用前景。隨著經濟發展和人們生活水平的不斷提高，社會對黃牛產品的需求不斷加強，但由于近年來牛肉、牛奶等產品嚴重短缺，所以黃牛育種專家期望更早、更好、更快地獲得黃牛產品的優良品種。在高產、優質和高效的黃牛育種目標上，黃牛育種專家一直關注生長發育性狀，但僅靠傳統育種手段是不行的，還需要依靠分子育種技術。即首先在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長發育性狀密切相關的DNA標記，然后進行基因多態性的檢測，最后是進行基因多態性與生長發育性狀的關聯分析，從而實現早期選擇。LncRNA是一種長度在200-100000nt之間的RNA分子，不編碼蛋白但卻參與細胞內多種過程調控(Merceretal.,2009)，其種類、數量、功能都不明確。目前發現的許多lncRNA都具有保守的二級結構，一定的剪切形式以及亞細胞定位。它們在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以分為5種：正義鏈(sense)、反義鏈(antisense)、雙向(bidirectional)、內含子間(intronic)、基因間(intergenic)(Kapranovetal.,2007；Coreetal.,2008；Guttmanetal.,2009；Merceretal.,2009；Orometal.,2010)，其所在的位置與其功能有一定的相關性。但人們對lncRNA的認識還處在初級階段，lncRNA起初被認為是基因組轉錄的"噪音"，是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具有生物學功能(Struhl,2007)。然而，近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾，核內運輸等多種重要的調控過程，lncRNA的這些調控作用也開始引起人們廣泛的關注。哺乳動物基因組序列中4％～9％的序列產生的轉錄本是lncRNA，相應的蛋白編碼RNA的比例是1％(Pontingetal.,2009)，雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，隨著研究的推進，各類lncRNA的大量發現，lncRNA的研究將是RNA基因組研究非常吸引人的一個方向，使人們逐漸認識到基因組存在人類知之甚少的"暗物質"。lncRNAs通常較長，具有mRNA樣結構，經過剪接，具有polyA尾巴與啟動子結構，分化過程中有動態的表達與不同的剪接方式。lncRNAs啟動子同樣可以結合轉錄因子，如Oct3/4，Nanog、CREB、Sp1、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：以待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1為四引物擴增受阻突變體系PCR引物，通過PCR擴增黃牛長鏈非編碼RNA?ADNCR基因片段；再對PCR擴增得到的片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定所述ADNCR基因單核苷酸多態位點的基因型；所述引物對P1為：上游內引物：5'?ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT?3'；下游內引物：5'?CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT?3'；上游外引物：5'?GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC?3'；下游外引物：5'?GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC?3'。

【技術特征摘要】
1.一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：以待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1為四引物擴增受阻突變體系PCR引物，通過PCR擴增黃牛長鏈非編碼RNAADNCR基因片段；再對PCR擴增得到的片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定所述ADNCR基因單核苷酸多態位點的基因型；所述引物對P1為：上游內引物：5'-ATGTACTCCTATTTCCTTGTGTTCGCAT-3'；下游內引物：5'-CAAAGTGCCCTGTAAAATGTAAAGTGTTT-3'；上游外引物：5'-GTCTTTATCTGGTTTTACATGCCCCTAC-3'；下游外引物：5'-GACATGCCTGGTCTCTTACTGTTTGTAC-3'。2.根據權利要求1所述一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法，其特征在于：所述單核苷酸多態性為長鏈非編碼RNAADNCR基因g.1263T>A突變。3.根據權利要求1所述一種黃牛ADNCR基因單核苷酸多態性的四引物擴增受阻突變體系PCR檢測方法，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：藍賢勇，金云云，張思歡，楊青，陳宏，雷初朝，黃永震，黨瑞華，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：陜西,61