一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒及其用途制造技術

本發明專利技術提出一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒及其用途。該試劑盒包括以下組分：酶標板、標準品、陰性對照品、陽性對照品、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、二抗、抗體稀釋液、顯色液和終止液；所述酶標板由一種特定的添加有生物素標簽的人源性asprosin蛋白的多克隆抗體包被，并用封閉緩沖液封閉；二抗能夠與作為一抗的多克隆抗體進行特異性的結合。該試劑盒能夠快速檢測人或者動物標本中的asprosin蛋白含量，耗時少，使用簡便，而且結果特異性強、敏感度高?；诖耍景l明專利技術還構建了用于輔助診斷多囊卵巢綜合征(PCOS)的檢測設備體系，該檢測設備體系只需再配置37℃溫箱、移液器和酶標儀。

ELISA detection kit for human derived asprosin protein and uses thereof

The present invention provides a ELISA detection kit for human derived asprosin protein and its use. The kit comprises the following components: microplate, standard, negative control, positive control, product sample dilution, washing buffer, two antibody, antibody dilution, color liquid and terminated liquid; the ELISA plate by a polyclonal antibody specific to the addition of human asprosin biotin label envelope and closed buffer closed; combined with the two anti can and as anti polyclonal antibodies were specific. The kit can rapidly detect the content of asprosin protein in human or animal specimens, and has the advantages of less time consumption, simple operation, high specificity and high sensitivity. Based on this, the present invention also constructs a detection system for assisting the diagnosis of polycystic ovary syndrome (PCOS). The detection system only needs to be configured with a 37 DEG temperature box, a pipette and a microplate reader.

【技術實現步驟摘要】
一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒及其用途
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒。
技術介紹
多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是一種最常見的生殖障礙和代謝性綜合征，一直以其高發生率(5％～10％)、多系統廣泛遷延以及各年齡段持續深遠的病理影響而成為婦科內分泌領域的研究熱點和難點之一。目前PCOS病因和發病機制仍不明確，胰島素抵抗(insulinresistance，IR)和高雄激素血癥(hyperandrogenemia，HA)是其主要的病理特征，也常伴有肥胖、糖代謝異常、心血管疾病等合并癥的發生。由于PCOS的異質性、臨床表現的多態性，給臨床診斷和治療帶來極大困難，PCOS的診斷一直是極具爭議的話題。目前，國際上先后有三個PCOS診斷標準被廣泛應用。第一個是來源于由NIH(美國國立衛生研究院)于1990年4月舉行的專家會議的報告。報告中指出PCOS的主要診斷標準應包括:雄激素過多癥和/或高雄激素血癥，月經失調，并排除其它已知疾病。這一調查把PCOS定義為是一種經過排除診斷后的雄激素過量性疾病，伴有卵巢的原因和/或結果。第二個是成形于2003年5月在鹿特丹召開的歐洲生殖和人類胚胎學會和美國生殖醫學會舉辦的專家會議。會議中提出PCOS的定義需至少滿足以下3個特點中的2個:①稀發和/或無排卵；②雄激素過多癥的臨床和/或生化表現；③多囊卵巢。診斷PCOS前也需要首先排除其它雄激素過量或相關疾病。2006年，AES(美國雄激素過多協會)提出第三個PCOS診斷標準，指出PCOS診斷必需滿足高雄激素這一特點，而排卵障礙和多囊卵巢存在二者之一即可診斷。三種標準從不同出發點給出了PCOS的定義，也凸顯出了對疾病不完全相同的認識，多個診斷標準的并存給臨床工作造成較大困難。一項涵蓋106項研究共15129例受試者的Meta分析顯示，PCOS患者發生超重、肥胖和中心性肥胖的風險比分別為1.95、2.77和1.73。對于糖耐量受損、糖尿病和代謝綜合征的識別在PCOS治療選擇時也有重要意義。數據表明與正常對照相比，PCOS患者上述三種代謝改變的發生風險分別增加2.48、4.43、2.88倍。多中心大數據的研究顯示，肥胖和糖代謝異?？勺鳛镻COS的輔助診斷標準。對于初診的PCOS患者，臨床一般是通過B超檢測、雄激素水平進行排除性診斷，國內外尚缺乏針對肥胖和糖代謝異常的PCOS診斷標志物。Asprosin是2016年4月《Cell》期刊報道的一種新型的葡萄糖調控蛋白質激素，由白色脂肪組織分泌、釋放并運輸至肝臟。研究發現，Asprosin可與肝細胞表面受體結合，通過激活G蛋白-cAMP-PKA信號通路來增加肝細胞中葡萄糖的釋放。同時Asprosin的作用是跟胰島素功能亢進相關，Asprosin含量的增加會導致胰島素的耐受性，進一步提高血糖的含量。上述研究表明，asprosin的含量和肥胖及高血糖呈正相關?？赡艹蔀榉逝旨疤谴x異常的標志物，亦可能成為PCOS的生物標志物，并作為輔助檢測來確診PCOS。目前，對Asprosin的研究僅有2016年《Cell》期刊上的一篇文獻報道，國內外尚無對其應用價值的報道，也無任何關于定量檢測人源性Asprosin含量的報道。其他研究中心獲悉asprosin及其意義后，雖然可能考慮也研制針對asprosin的Elisa試劑盒，但此試劑盒的研發和驗證不僅需要復雜的分析、實驗，還需要大量的樣本數據支持，常規的有限實驗很難完成這一探究過程，實現其臨床價值及推廣應用。
技術實現思路
本專利技術的初衷是克服目前PCOS患者尚無明確診斷的問題，提出一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒及其應用。該試劑盒能夠快速檢測人或者動物標本中的asprosin蛋白含量，耗時少，使用簡便，而且結果特異性強、敏感度高。本專利技術的技術方案如下：本專利技術利用ELISA技術建立了檢測人源性asprosin蛋白的試劑盒，并首次證實在PCOS患者的血漿中，asprosin蛋白的含量顯著高于正常人群。本專利技術第一方面，提供了一種人源性asprosin蛋白的多克隆抗體制備方法，步驟如下：步驟一，根據asprosin基因(以下簡寫為A基因)序列，以及大腸桿菌原核蛋白表達的偏好，在保證A基因的氨基酸序列一致的前提下，優化A基因的原始密碼子，并設計引物，進行PCR擴增(原始密碼子、優化后的密碼子、引物見表1)；步驟二，將PCR擴增到的A基因和載體質粒pET15b和分別用NdeI和XhoI雙酶切并分別回收，之后將A基因的酶切產物連接到酶切后的pET15b載體質粒上，得到pET15b-A重組質粒，轉化到大腸桿菌DH5α感受態菌株，37℃培養過夜后，挑取菌落進行培養后抽提質粒DNA，進行NdeI和XhoI雙酶切鑒定和DNA測序鑒定，獲得序列正確的pET15b-A重組質粒進行保存；步驟三，將步驟二所述的測序正確的pET15b-A重組質粒轉化至大腸桿菌BL21表達宿主菌體中，優化重組A蛋白的誘導條件；步驟四，超聲破碎步驟三所述的BL21表達宿主菌體，12000rpm，4℃，離心20min，收集沉淀后用包涵體溶解液進行重溶，之后采用12％的SDS-PAGE膠檢測重組A蛋白的表達情況；步驟五，采用Ni-瓊脂糖親和層析法，純化步驟四所述的重組A蛋白，采用12％的SDS-PAGE膠檢測重組A蛋白的純化效果；步驟六，用純化得到的asprosin免疫健康雌性新西蘭大白兔(4月齡，2.1kg)，初免蛋白劑量為0.5mg/只，二免、三免、四免蛋白劑量為0.25mg/只，初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化；步驟七，四免后(第56天)耳靜脈采血1ml，ELISA檢測抗體效價，效價達到要求，第57天，頸動脈終放血收集抗血清。步驟八，親和層析法純化抗血清中的抗體，ELISA檢測純化后所得抗體的效價，確定最佳的抗體稀釋比。優化的，為了提高目的蛋白的表達水平，優化其誘導條件，最終確定為在菌液OD值達到0.6時，添加終濃度為0.5mM的IPTG，220rpm，37℃誘導4h。優化的，為了提高ELISA檢測asprosin蛋白濃度的靈敏度，針對此抗體添加生物素標簽，用于將來ELISA檢測時與二抗進行特異性結合，從而提高ELISA的靈敏度。本專利技術第二方面，提供了一種人源性asprosin蛋白的ELISA檢測試劑盒，包括以下組分：酶標板、標準品、陰性對照品、陽性對照品、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、二抗、抗體稀釋液、顯色液和終止液；所述酶標板采用上述添加有生物素標簽的多克隆抗體包被，并用封閉緩沖液封閉；所述二抗能夠與作為一抗的所述添加有生物素標簽的多克隆抗體進行特異性的結合。優化的，二抗選擇HRP標記的鏈霉親和素，效果最佳。優化的，酶標板為96孔酶標板，具體采用美國Corning的聚苯乙烯塑料板。優化的，所述封閉緩沖液由3％牛血清白蛋白(BSA)、3％的脫脂奶粉和0.05％的PBST組成，37℃條件封閉1h；所述樣品稀釋液：樣品為血漿、血清時，樣品稀釋液為pH7.4的1×PBS；或者樣品為細胞上清液時，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人源性asprosin蛋白的多克隆抗體在制備該蛋白的ELISA檢測試劑盒中的用途，在制備所述人源性asprosin蛋白的多克隆抗體的過程中采用了說明書表1中限定的優化后基因序列和引物進行PCR擴增。

【技術特征摘要】
1.一種人源性asprosin蛋白的多克隆抗體在制備該蛋白的ELISA檢測試劑盒中的用途，在制備所述人源性asprosin蛋白的多克隆抗體的過程中采用了說明書表1中限定的優化后基因序列和引物進行PCR擴增。2.根據權利要求1中所述的用途，其特征在于：所述人源性asprosin蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：步驟一，根據asprosin基因序列，以及大腸桿菌原核蛋白表達的偏好，在保證asprosin基因的氨基酸序列一致的前提下，設計得到所述優化后基因序列和引物，進行PCR擴增；以下asprosin簡稱A；步驟二，將PCR擴增到的A基因和載體質粒pET15b和分別用NdeI和XhoI雙酶切并分別回收，之后將A基因的酶切產物連接到酶切后的pET15b載體質粒上，得到pET15b-A重組質粒，轉化到大腸桿菌DH5α感受態菌株，37℃培養過夜后，挑取菌落進行培養后抽提質粒DNA，進行NdeI和XhoI雙酶切鑒定和DNA測序鑒定，獲得序列序列正確的pET15b-A重組質粒進行保存；步驟三，將步驟二所述的測序正確的pET15b-A重組質粒轉化至大腸桿菌BL21表達宿主菌體中，優化重組A蛋白的誘導條件；步驟四，超聲破碎步驟三所述的BL21表達宿主菌體，12000rpm，4℃，離心20min，收集沉淀后用包涵體溶解液進行重溶，之后采用12％的SDS-PAGE膠檢測重組A蛋白的表達情況；步驟五，采用Ni-瓊脂糖親和層析法，純化步驟四所述的重組A蛋白，采用12％的SDS-PAGE膠檢測重組A蛋白的純化效果；步驟六，用步驟五純化得到的A蛋白免疫健康雌性新西蘭大白兔，初免蛋白劑量為0.5mg/只，二免、三免、四免蛋白劑量為0.25mg/只，初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化，二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化；步驟七，四免后，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測抗體效價，效價達到要求，第二天頸動脈...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李博，陳書強，王晶晶，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第四軍醫大學，
類型：發明
國別省市：陜西,61