用于制備針對因腸致病性細菌引起的感染的廣譜疫苗的包含表達內(nèi)置的多個表位的分子構(gòu)建體的基本單元的糖綴合物疫苗制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及表達內(nèi)置的多個表位的新的糖綴合物抗原和旨在用于保護哺乳動物的多價糖綴合物疫苗，特別是用于保護人類群體免受腸致病性細菌的影響和/或免受因人諾如病毒引起的病毒胃腸道感染的影響，所述腸致病性細菌為例如革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、銅綠假單胞菌。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于制備針對因腸致病性細菌引起的感染的廣譜疫苗的包含表達內(nèi)置的多個表位的分子構(gòu)建體的基本單元的糖綴合物疫苗本專利技術(shù)涉及表達內(nèi)置的多個表位的新的糖綴合物抗原和旨在用于保護哺乳動物的多價糖綴合物疫苗，特別是用于保護人類群體免受腸致病性細菌的影響和/或免受因人諾如病毒引起的病毒胃腸道感染的影響，所述腸致病性細菌為例如革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌(Clostridiumdifficile)和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、大腸桿菌(EscherichiaColi)、霍亂弧菌(VibrioCholerae)、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiA)、宋氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholerasuis)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、腸桿菌(Enterobacter)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。艱難梭菌是產(chǎn)生對人類為致病性的兩種外毒素(腸毒素A和細胞毒素B)的孢子形成革蘭氏陽性桿菌。艱難梭菌是發(fā)達國家老年住院患者中抗生素相關(guān)感染性腹瀉的主要原因(Simor等人,2002)。艱難梭菌相關(guān)疾病(CDAD)的癥狀范圍從腹瀉到嚴重結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸、敗血癥和死亡。近年來，疾病發(fā)病率、嚴重程度和復(fù)發(fā)率的增加主要是由于與流行性醫(yī)院爆發(fā)相關(guān)的高毒性菌株的出現(xiàn)以及對常用抗生素的抗性的增加(Rupnik等人，2009)。能夠中和艱難梭菌腸毒素A和細菌毒素B(該病原體的兩種毒素)的預(yù)防性疫苗被報道為在工業(yè)發(fā)展下的候選疫苗實例(DonaldR.等人，2013)。毒素A和B分別是308kDa和270kDa的非常大的蛋白質(zhì)，其在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，共享介導(dǎo)細胞毒性葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的細胞內(nèi)攝取和遞送的同源功能結(jié)構(gòu)域。毒素A(腸毒素)由2,710個AA組成，并在其序列中顯示223個Lys殘基(8.22％陽離子性)；毒素B(細胞毒素)由2,366個AA組成，并在其序列中顯示156個Lys殘基(6.59％陽離子性)(參見參考網(wǎng)址：http://www.uniprot.org/uniprot/P16154和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AGG91548.1)。盡管這兩種毒素在“體內(nèi)”模型中的效力和效果各不相同，但過去在動物模型中的研究表明它們都促成天然感染中的疾病(Lyerly等人，1985)。此外，用毒素A和毒素B的疫苗接種(但不用單獨的任一個進行免疫接種)在感染的倉鼠模型中賦予保護(LibbyJ.M.等人，1982)。體液免疫應(yīng)答控制CDAD的能力的識別促進了將使用含有抗毒素A和B抗體的匯集的人免疫球蛋白的被動免疫治療成功用于治療嚴重的CDAD(SalcedoJ.等人，1997)。此外，在使用A和B抗-毒素單克隆抗體結(jié)合標準抗生素治療的I期臨床試驗中實現(xiàn)了CDAD復(fù)發(fā)的減少(LowyI.等人，2010)。此外，在三名患有慢性復(fù)發(fā)性CDAD的小型研究中，使用福爾馬林滅活的A和B類毒素抗原的研究性疫苗防止CDAD復(fù)發(fā)(SougioultzisS.等人，2005)。總的來說，這些觀察結(jié)果提供了基于艱難梭菌毒素A和基于艱難梭菌毒素B的疫苗防止CDAD的驗證并鼓勵其進一步發(fā)展。如上所述，現(xiàn)在在臨床試驗中存在兩種候選疫苗，其基于兩種重組/福爾馬林處理的類毒素蛋白A和B。用于開發(fā)基于針對艱難梭菌類毒素的單一特異性的疫苗的策略(通過福爾馬林處理或通過DNA重組技術(shù)解毒)被良好地記載，如上所述。還有被良好記載的是使用艱難梭菌重組腸毒素A(rARU)作為用于被制備為單一綴合物的弗氏志賀氏菌(S.flexneri)2a型、大腸桿菌K1和肺炎球菌14型的莢膜Ps的每一種的載體蛋白的研究(PavliakovaD.等人，2000)。顯然，由于注射的載體蛋白質(zhì)(即艱難梭菌腸毒素A的重組重復(fù)單元)的總量(而非異質(zhì)性)(對于各綴合物Pn14-rARU、SF-rARU和K1-rARU分別為1.29μg、3.9μg和8.08μg的rARU)，單一的三種綴合物的同時施用不可避免地導(dǎo)致宿主的免疫系統(tǒng)的過載這是。最近，該兩種毒素的結(jié)構(gòu)部分已被用作用于艱難梭菌的PsII抗原的無毒載體(RomanoM.等人，2014)。雖然艱難梭菌還產(chǎn)生三種不同的莢膜Ps，但證據(jù)指向兩種毒素作為有效戰(zhàn)斗病理學(xué)的靶，如在白喉和破傷風(fēng)感染的歷史病例中的。然而，這些以前的工作沒有報道關(guān)于制備用于在人類宿主(特別是兒童)中誘導(dǎo)針對來自抗生素抗性腸致病性細菌的幾種碳水化合物抗原的免疫(多特異性)(同時使用最小量的載體蛋白來減少疫苗對宿主免疫系統(tǒng)的抗原性負荷，同時保持通過施用單價綴合物可定性實現(xiàn)的特異性免疫原活性和體內(nèi)保護)的廣譜腸疫苗的可能性。然而，與單價抗體相比，動物模型不允許在由本專利技術(shù)的多種抗原誘導(dǎo)的抗體滴度的定量方面得出結(jié)論，因為本領(lǐng)域的專家公知的是，只有人類嬰兒可以可靠地區(qū)分綴合物實體的不同模型的最終不同的輔助T-依賴性活性。本專利技術(shù)的作者現(xiàn)已獲得了多表位分子構(gòu)建體作為用于制備多表位糖綴合物疫苗的基本單元，所述多表位糖綴合物疫苗用作用于保護人群免受腸致病性細菌影響的廣譜腸疫苗。事實上，本專利技術(shù)的作者集中于目前對于已經(jīng)變成抗生素抗性的幾種腸道病原體報道的緊迫問題：革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、銅綠假單胞菌。由于它們的與日俱增的抗生素抗性，因這組細菌引起的腸道感染可能經(jīng)常導(dǎo)致敗血癥，從而導(dǎo)致宿主死亡。因此，本專利技術(shù)的目的是由包含共價結(jié)合至來自腸致病性細菌的不同血清學(xué)特異性的最少三個碳水化合物結(jié)構(gòu)的輔助T-依賴性載體解毒的蛋白的基本單元組成的抗原性多價分子構(gòu)建體，所述輔助T-依賴性載體解毒的蛋白選自來自艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B，所述碳水化合物結(jié)構(gòu)選自細菌多糖或解毒的脂多糖(例如SAEP-解毒的LPS或類內(nèi)毒素)，其中每個碳水化合物結(jié)構(gòu)包含至少一個由最少5至12個單糖殘基(優(yōu)選最少8至12個單糖殘基)組成的重復(fù)基本表位，其中至少1摩爾的載體蛋白共價結(jié)合至少1摩爾的類型特異性或群特異性碳水化合物結(jié)構(gòu)，或共價結(jié)合碳水化合物結(jié)構(gòu)的總量，所述總量被認為是所述至少三種類型特異性或群特異性碳水化合物的總和。優(yōu)選地，通過分子質(zhì)量測定和NMR波譜評估所述糖殘基，所述重復(fù)基本表位通過與類型特異性或群特異性多克隆或單克隆抗體的反應(yīng)性(通過測定它們在抑制它們的同源性多糖-抗體參考系統(tǒng)中的各自MIC50值)進行抗原性評估。根據(jù)本專利技術(shù)的腸致病性細菌是已經(jīng)變得抗生素抗性的腸病原體，例如：革蘭氏陽性厭氧細菌艱難梭菌和革蘭氏陰性細菌傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、弗氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
由包含共價結(jié)合至來自腸致病性細菌的不同血清學(xué)特異性的最少三個碳水化合物結(jié)構(gòu)的輔助T?依賴性載體解毒的蛋白的基本單元組成的抗原性多價分子構(gòu)建體，所述輔助T?依賴性載體解毒的蛋白選自來自艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B，所述碳水化合物結(jié)構(gòu)選自細菌多糖或解毒的脂多糖，其中每個碳水化合物結(jié)構(gòu)包含至少一個由最少5至12個單糖殘基組成的重復(fù)基本表位，其中至少1摩爾的載體蛋白結(jié)合至少1摩爾的所述至少三個碳水化合物結(jié)構(gòu)的每一個或其摩爾總和。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.07.25 IT MI2014A0013611.由包含共價結(jié)合至來自腸致病性細菌的不同血清學(xué)特異性的最少三個碳水化合物結(jié)構(gòu)的輔助T-依賴性載體解毒的蛋白的基本單元組成的抗原性多價分子構(gòu)建體，所述輔助T-依賴性載體解毒的蛋白選自來自艱難梭菌的腸類毒素A和細胞類毒素B，所述碳水化合物結(jié)構(gòu)選自細菌多糖或解毒的脂多糖，其中每個碳水化合物結(jié)構(gòu)包含至少一個由最少5至12個單糖殘基組成的重復(fù)基本表位，其中至少1摩爾的載體蛋白結(jié)合至少1摩爾的所述至少三個碳水化合物結(jié)構(gòu)的每一個或其摩爾總和。2.權(quán)利要求1所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其中所述腸類毒素A或細胞類毒素B源自通過優(yōu)選通過福爾馬林處理的化學(xué)方法或通過DNA重組技術(shù)解毒的艱難梭菌的天然同源毒素。3.前述權(quán)利要求1-2中任一項所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其中攜帶的所述不同血清學(xué)特異性的碳水化合物結(jié)構(gòu)選自傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、大腸桿菌和艱難梭菌或其組合的莢膜多糖。4.前述權(quán)利要求1-3中任一項所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其中所述解毒的脂多糖是類內(nèi)毒素。5.權(quán)利要求1或4所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其中攜帶的所述不同血清學(xué)特異性的碳水化合物結(jié)構(gòu)選自腸致病性細菌的解毒的脂多糖/類內(nèi)毒素，所述腸致病性細菌選自傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、宋氏志賀氏菌和豬霍亂沙門氏菌或其組合。6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其選自：-共價結(jié)合至傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌的莢膜多糖的腸類毒素A；-共價結(jié)合至傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌和大腸桿菌的莢膜多糖的細胞類毒素B；-共價結(jié)合至腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的解毒的脂多糖/類內(nèi)毒素的腸類毒素A；-共價結(jié)合至腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌和痢疾沙門氏菌的解毒的脂多糖/類內(nèi)毒素的細胞類毒素B。7.前述權(quán)利要求中任一項所述的抗原性多價分子構(gòu)建體，其用于疫苗，用于保護受試者免受因選自下述的至少一種腸致病性細菌引起的感染：艱難梭菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌或其組合。8.一種疫苗制劑，其包含在生理學(xué)上可接受的媒介物中的至少一種如權(quán)利要求1-6中任一項所定義的抗原性多價分子構(gòu)建體，任選地與藥學(xué)上可接受的佐劑或賦形劑一起。9.權(quán)利要求8所述的疫苗制劑，其中每種載體抗原和/或攜帶的抗原的劑量范圍為0.1至100μg，優(yōu)選為1至10μg。10.權(quán)利要求8-9中任一項所述的疫苗制劑，其中所述佐劑選自：選自磷酸鋁、氫氧化鋁的礦物佐劑；選自基于角鯊烯的佐劑如MF59、QF21、Addavax的有機佐劑；和選自單磷酰基脂質(zhì)A和海藻糖二糖霉菌酸的生物佐劑。11.權(quán)利要求8-10中任一項所述的疫苗制劑，其中所述佐劑的量為0.1-1mg/劑量，優(yōu)選0.5mg/劑量。12.權(quán)利要求8-11中任一項所述的疫苗制劑，所述制劑適于通過皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮途徑施用。13.前述權(quán)利要求8-12中任一項所述的廣譜多價疫苗制劑，其用于醫(yī)學(xué)人類...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：M·波羅，
申請(專利權(quán))人：碧奧辛斯有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：意大利,IT