一種保護脫氧核苷－３′－氰乙基－Ｎ，Ｎ－二異丙基亞磷酰胺是由保護脫氧核苷采用β－氰乙基－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，－四異丙基亞磷酰二胺為磷酰化試劑及四唑和／或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中進行磷酰化反應而成，產物分離純化的后處理工藝簡單。因此本法具有實用性，適用于大規模生產。（*該技術在2012年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術是一種保護脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺的制備方法。保護脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(以下簡稱β-氰乙基亞磷酰胺)是80年代出現的一種新型DNA合成試劑，廣泛用于自動或半自動的固相法合成寡核苷酸引物、探針或基因。由于β-氰乙基亞磷酰胺在活化劑作用下，反應活性和甲基亞磷酰胺幾乎相等，而在DNA合成完畢最終脫保護基時前者可以和其它保護基一起用濃氨水處理脫去，后者則首先需用氣味難聞的硫酚除去。關于β-氰乙基亞磷酰胺的制備方法已有文獻報道，如在期刊Nucleic Acids Research 12(11)，4539，1984，中報道采用β-氰乙基二異丙胺基亞磷酰氯為磷酰化試劑，反應條件難控制、還要用二異丙基乙胺作為除酸劑，產物后處理需要在-78℃條件下操作，條件苛刻，實用性差。又如在M.J.Gait，Oligonucleotide Synthesis，a practical approach，P.41-45，IRL Press，Oxford，1984，中報道用甲基-N，N-二異丙胺亞磷酰氯為磷酰化試劑制得核苷甲氧基亞磷酰胺產物時，需用制備色譜或柱層析純化才能得純品，該法難于實現大規模生產。為此，本專利技術目的是尋找一種保護脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺新的制備方法，采用易得的磷酰化試劑和適宜的活化劑進行磷酰化反應，產物分離純化的方法簡易，適宜于大規模生產。本專利技術β-氰乙基亞磷酰胺的制備是由保護脫氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺為磷酰化試劑及四唑和/或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中進行磷酰化反應而成，最后用乙腈處理得純產物。本專利技術制備方法可用下式表示 B＝腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶;i-Pr＝異丙基保護脫氧核苷是保護脫氧腺嘌呤核苷，保護脫氧鳥嘌呤核苷，保護脫氧胞嘧啶核苷及保護脫氧胸腺嘧啶核苷。活化劑中的四唑二烷基胺鹽如四唑二乙胺鹽，四唑二異丙胺鹽及四唑二丙胺鹽等。活化劑中四唑與四唑二烷基胺鹽的克分子比為0-1∶1-0。極性溶劑可以是鹵代烷，如二氯甲烷，三氯甲烷，1，2-二氯乙烷;吡啶類如吡啶，六氫吡啶，2，6-二甲基吡啶;酰胺類如二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺，二甲基乙酰胺等。本專利技術β-氰乙基亞磷酰胺的制備方法是將保護脫氧核苷，活化劑四唑和/或四唑二烷基胺鹽及極性有機溶劑放入反應瓶中，為一不均相體系，然后滴加入磷酰化試劑β-氰乙基N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，在室溫下攪拌反應1-10小時，隨著反應進行不均相體系逐漸轉變為均勻的液相體系。用薄層層析法檢測反應。待反應完成后，用碳酸氫鈉飽和溶液洗滌，除去無機雜質及活化劑，再用氯化鈉飽和溶液洗滌，分離出有機層，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾后抽去溶劑，殘余糖漿狀物用甲苯或二甲苯(對嘧啶類核苷)或用乙酸甲酯或乙酸乙酯(對嘌呤類核苷)溶解，攪拌下滴入預冷的(0～-20℃)正己烷或環己烷中析出沉淀，過濾，把此沉淀在預冷的正己烷中研磨成白色粉末，過濾干燥后，再把此白色粉末溶解于無水乙腈中，過濾去不溶物，真空抽去溶劑乙腈，收集研磨發泡的白色固體產物，即為β-氰乙基亞磷酰胺。產率可達60.1-91.3%產物的外觀及物理常數與文獻報道值一致。在反應中保護脫氧核苷，磷酰化試劑與活化劑之用量克分子比是1∶0.8-3∶0.2-1。每毫克分子保護脫氧核苷需用極性溶劑量為0.5-1毫升。本專利技術制備方法的優點是采用容易制得的磷酰化試劑及適宜的四唑和/或四唑二烷基胺鹽作為活化劑的反應體系，能充分有效地使磷酰化反應完全，并且產物分離純化后處理工藝簡單，因此本法具有實用性，適用于大規模生產。用以下實施例來說明本專利技術，但本專利技術范圍并不限于此。實施例1在一反應瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護脫氧胸腺嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺鹽及0.14克四唑(2毫克分子)，及25毫升無水二氯甲烷，此時體系為固液非均相。室溫攪拌下滴加入15克(50毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫攪拌反應4小時，反應液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測反應，待反應完成后，將反應液倒入100毫升干氯仿(或干二氯甲烷中)，用碳酸氫鈉飽和溶液洗滌(3×150毫升)上述氯仿溶液，再用氯化鈉飽和溶液洗滌(3×150毫升)，分離出有機層，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，室溫下減壓濃縮抽去溶劑，殘余糖漿狀物用80毫升甲苯溶解，攪拌下滴入預冷的(0～20℃)的正己烷中析出沉淀，過濾，將此沉淀再次用80毫升甲苯溶解，攪拌滴入預冷的正己烷中析出沉淀，將收集的沉淀物在預冷的正己烷中研磨成粉末，在充滿氮氣的干燥箱中過濾收集該白色粉末，再真空干燥5小時，然后用無水乙腈100毫升溶解干白色粉末，在氮氣干燥箱中過濾去掉不溶物，再真空抽去乙腈，產物發泡成白色片狀，研磨，再真空干燥得純產物保護脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺26克，產率為87.3%。實施例2在一反應瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保護脫氧胞嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺鹽和1.7克(24毫克分子)四唑及40毫升無水吡啶，此時體系為固液非均相。室溫攪拌下滴加入18克(60毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫攪拌反應3小時，反應液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測反應，待反應完成后，后處理同實施例1，得純產物保護脫氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺26.8克，產率為80.5%。實施例3在一反應瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護脫氧胸腺嘧啶核苷，2.8克(16毫克分子)四唑二丙胺鹽和0.56克(8毫克分子)四唑及30毫升二乙基甲酰胺，此時體系為固液非均相。室溫攪拌下滴加入12克(40毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫攪拌反應6小時，反應液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測反應，待反應完成后，后處理同實施例1，得純產物保護脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺18.2克，產率為61.2%。實施例4在一反應瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保護脫氧胞嘧啶核苷，2.7克(19.2毫克分子)四唑二乙胺鹽和0.14克(2毫克分子)四唑及20毫升氯仿，此時體系為固液非均相。室溫攪拌下滴加入14.5克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫攪拌反應5小時，反應液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測反應，待反應完成后，后處理同實施例1，但甲苯溶解改為二甲苯溶解，得純產物保護脫氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺30.2克，產率為90.5%。實施例5在一反應瓶中抽真空通氮，加入26.3克(40毫克分子)保護脫氧腺嘌呤核苷，3克(18毫克分子)四唑二乙丙胺鹽和0.14克(2毫克分子)四唑及40毫升無水二甲基乙酰胺，此時體系為固液非均相。室溫攪拌下滴加入24克(80毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫攪拌反應10小時，反應液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測反應，待反應完成后本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用磷酰化反應制備保護脫氧核苷－３＇－氰乙基－Ｎ，Ｎ－二異丙基亞磷酰胺的方法，其特征在于是由保護脫氧核苷采用β－氰乙基－Ｎ，Ｎ，Ｎ＇，Ｎ＇－四異丙基亞磷酰二胺為磷酰化試劑及四唑和／或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中于室溫下進行反應，反應中保護脫氧核苷，磷酰化試劑與活化劑用量的克分子比為１∶０．８－３∶０．２－１，活化劑中四唑與四唑二胺基胺鹽的克分子比為０－１∶１－０，反應時間是１－１０小時。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣飛龍，
申請(專利權)人：蔣飛龍，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]
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