一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用，其中，該免疫細(xì)胞凍存液包含：2?10體積％的DMSO；2?15體積％的HSA；20?88體積％的血漿，以及可選的加入白酒草皂苷R；以及余量培養(yǎng)基。該凍存液能夠有效保存免疫細(xì)胞，并且保存時(shí)間長，細(xì)胞復(fù)蘇后恢復(fù)能力強(qiáng)，細(xì)胞回收率高。

Immune cell frozen liquid and application thereof

The present invention discloses immune cell freezing medium and its application, which contains the liquid freezing immune cells: 2 10 vol% DMSO; 2 15 vol% HSA; 20 88 volume% of the plasma, and optionally adding liquor grass saponin R; and the remainder of the medium. The cryopreservation solution can effectively preserve the immune cells, and the storage time is long, and the recovery ability of the cells after recovery is strong, and the recovery rate of the cells is high.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地，涉及免疫細(xì)胞凍存液、用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒以及凍存免疫細(xì)胞的方法。
技術(shù)介紹
細(xì)胞冷凍技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法在生物學(xué)領(lǐng)域已有深入廣泛的應(yīng)用。對(duì)供體的免疫細(xì)胞深低溫保存可保持其活力和功能，無論對(duì)臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要意義，尤其是免疫細(xì)胞用于回顧性研究時(shí)更為重要。冷凍保存免疫細(xì)胞不僅可以解決現(xiàn)有免疫細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間較長，需要多次誘導(dǎo)和患者多次采血的問題，還可以把人健康狀態(tài)最好或戰(zhàn)斗力最強(qiáng)時(shí)期的免疫細(xì)胞保存下來，用于腫瘤治療以及抗衰老保健治療。正常情況下，液體凍結(jié)時(shí)會(huì)造成細(xì)胞損傷，其中，一種情況是由于不適當(dāng)?shù)慕禍睾蛷?fù)蘇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶和重結(jié)晶；另一種情況是由于冷凍使得電解質(zhì)和溶質(zhì)濃度升高所導(dǎo)致的溶質(zhì)損傷。通常，免疫細(xì)胞在-70℃～-80℃凍存，細(xì)胞活性會(huì)隨著冷凍時(shí)間的延長迅速下降，在-196℃時(shí)細(xì)胞生物學(xué)過程幾乎停止，因此要長期保存免疫細(xì)胞，液氮溫度是最佳的儲(chǔ)存溫度。目前現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液不能有效保存大規(guī)模培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞活力都無法滿足臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)后，必須短時(shí)間內(nèi)盡快應(yīng)用，否則就只能廢棄。由此，適用于大量的免疫細(xì)胞的體外凍存液有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本專利技術(shù)的一個(gè)目的在于提出一種用于免疫細(xì)胞長期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其細(xì)胞特性的凍存液。需要說明的是，本專利技術(shù)是基于專利技術(shù)人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：DMSO是常用的細(xì)胞冷凍保存劑，單獨(dú)使用保存免疫細(xì)胞存活率低。因而，專利技術(shù)人致力于尋找能夠促進(jìn)冷凍保存下免疫細(xì)胞存活率的成分，以便與DMSO聯(lián)用，以便通過其與DMSO協(xié)同作用，達(dá)到能夠長期保存免疫細(xì)胞的效果。例如，專利技術(shù)人利用DMSO(二甲基亞砜，Dimethylsulfoxide)協(xié)同海藻糖對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率明顯下降，冷凍保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷凍復(fù)蘇過程中能夠調(diào)節(jié)滲透壓，而血漿中又含有多種營養(yǎng)成分，因而，專利技術(shù)人嘗試將血漿和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)與DMSO結(jié)合，制備免疫細(xì)胞的凍存液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種凍存液對(duì)凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。白酒草系菊科白酒草屬植物Conyzajaponica(Thunb.)Less的全草，顏世倫等曾經(jīng)報(bào)道從白酒草中分離得到化合物白酒草皂苷R，結(jié)構(gòu)鑒定為3-O-β-D-glucopyranosylmedicagenicacid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosylester，其結(jié)構(gòu)式為：本專利技術(shù)人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，微量白酒草皂苷R，血漿和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)與DMSO結(jié)合制備免疫細(xì)胞的凍存液，可以降低DMSO的使用量，這種凍存液對(duì)凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。因而，根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)方面，本專利技術(shù)提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，該凍存液包含2-10體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。專利技術(shù)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞回收率高。因而，根據(jù)本專利技術(shù)的另一個(gè)方面，本專利技術(shù)提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，該凍存液包含0.2-0.8體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。專利技術(shù)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞回收率高。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述DMSO的濃度為10體積％。由此，對(duì)免疫細(xì)胞的凍存效果好。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述HSA的濃度為5體積％。由此，冷凍復(fù)蘇過程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且保證凍存液成本。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例所述血漿的濃度為40體積％。由此，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述血漿為自體血漿。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。由此，凍存效果好。根據(jù)本專利技術(shù)的另一方面，本專利技術(shù)還提供了一種用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒，其包含前面所述的免疫細(xì)胞凍存液。專利技術(shù)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，且細(xì)胞有效保存時(shí)間長，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。根據(jù)本專利技術(shù)的又一方面，本專利技術(shù)還提供了一種凍存免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，該方法利用前面所述的免疫細(xì)胞凍存液或者試劑盒，凍存所述免疫細(xì)胞。專利技術(shù)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞有效保存時(shí)間長，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，每106-109個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的凍存，并且單位體積的凍存液保存的細(xì)胞量大，適宜大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存。根據(jù)本專利技術(shù)的具體示例，每107-108個(gè)免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，細(xì)胞凍存效果好。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，進(jìn)一步包括：將含有所述免疫細(xì)胞的所述免疫細(xì)胞凍存液或者所述的試劑盒進(jìn)行程序降溫處理，所述程序降溫處理的條件為：0-2分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從4攝氏度下降到-1攝氏度；2-3分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-1攝氏度上升到0攝氏度；3-6分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持0攝氏度；6-11分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從0攝氏度下降到-10攝氏度；11-16分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-10攝氏度；16-50分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-10攝氏度下降到-45攝氏度；50-85分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-45攝氏度；85-95分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度從-45攝氏度下降到-90攝氏度；95-100分鐘，所述免疫細(xì)胞的溫度保持-90攝氏度。由此，通過程序降溫避免冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞器免受損傷有利于細(xì)胞長期保持，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用好。本專利技術(shù)的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本專利技術(shù)的實(shí)踐了解到。本專利技術(shù)的有益之處在于：本專利技術(shù)提出一種用于免疫細(xì)胞長期保存，并能夠在復(fù)蘇后保持其細(xì)胞特性的凍存液。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本專利技術(shù)的實(shí)施例，所述實(shí)施例僅用于解釋本專利技術(shù)，而不能理解為對(duì)本專利技術(shù)的限制。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)方面，本專利技術(shù)提供了一種免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本專利技術(shù)實(shí)施例，該細(xì)胞凍存液凍存的細(xì)胞種類不受特別的限制，只要凍存液能用于長期保存細(xì)胞即可。根據(jù)本專利技術(shù)的實(shí)施例，該凍存液包含2-10體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。專利技術(shù)人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于保存免疫細(xì)胞，并且凍存時(shí)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，包含：2?10體積％的DMSO；2?15體積％的HSA；20?88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種免疫細(xì)胞凍存液，其特征在于，包含：2-10體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述DMSO的濃度為10體積％。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述HSA的濃度為5體積％。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存液，其特征在于，所述血漿的濃度為40體積％，任選地，所述培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述凍存液，其特征在于，所述血漿為自體血漿。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述凍存液，其特征在于，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。7.一種用于凍存免疫細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液。8.一種凍存免疫細(xì)胞的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的免疫細(xì)胞凍存液或者權(quán)利要求7所述的試劑盒，凍存所述免疫細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐智峰，王輝，
申請(專利權(quán))人：廣州沙艾生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44