一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體及其制備方法與應用技術

本發明專利技術主要是涉及一種預防牛支原體病的特異性卵黃抗體及其制備方法與應用。采用改良的Thiaucourt

Specific yolk antibody for preventing Mycoplasma bovis disease, preparation method and application thereof

The invention mainly relates to a specific yolk antibody for preventing bovine mycoplasma disease, a preparation method and an application thereof. Using improved Thiaucourt

【技術實現步驟摘要】
一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體及其制備方法與應用
本專利技術屬于家畜疾病預防與控制
，涉及制備牛支原體的滅活疫苗和一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體的制備方法及在預防奶牛感染牛支原體中的應用。
技術介紹
牛支原體(Mycoplasmabovis)又被稱為牛霉形體，是感染牛的一種重要的致病性支原體。主要引起牛呼吸系統疾病、乳腺炎、關節炎等多種疾病。該病分布廣泛，遍布歐洲、美洲、大洋洲和亞洲等地區，使全世界養牛業蒙受了巨大的經濟損失，其中尤以歐洲最為嚴重。在美國，牛支原體所造成的損失每年達1.4億美元，單獨由牛支原體引起的牛只生長緩慢所致的損失每年就高達3200萬美元，單個牛場的牛支原體感染可高達70%。在歐洲，每年因牛病損失的5.79億歐元中有1/3是由牛支原體引起的。在英國，約有190萬頭牛患有牛支原體肺炎，死亡可達15.7萬頭，經濟損失超過5400萬英鎊，在這些呼吸道感染牛中，至少有1/4是由牛支原體引起的。自2008年以來，我國部分地區新從外地引進肉牛暴發了以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，發病率為50%～100%，病死率高達10%～50%，給我國養牛業造成了隨巨大的經濟損失。隨著牛支原體感染范圍的擴大和牛支原體引起疾病的發展及造成的經濟損失巨大，這引起了人們的廣泛關注，使如何有效防控牛支原體病逐漸成為養牛業研究關注的焦點。目前，牛支原體對世界的養牛業危害嚴重，藥物治療效果不明顯，疫苗研制已成為開發重點。但是目前國內外缺乏安全有效的牛支原體疫苗，造成牛支原體疾病近幾年不斷的傳播和蔓延，加之抗生素的濫用導致很多疾病對抗生素的耐藥性增加，研制一種像益生菌、中草藥一樣的沒有耐藥性的治療及預防的藥物成了目前科學家研究的重點。因此，研發一種高效安全易于服用的抗體疫苗，是本病防治急需解決的問題然而隨著卵黃抗體(IgY)的研究深入，國內外學者發現并報道了利用卵黃抗體可預防和治療畜禽各種疾病，并取得了良好效果。卵黃抗體是雞被外來抗原刺激后，所產生的特異性抗體聚集在卵黃內，通過相應技術對卵黃抗體進行提取，制成卵黃抗體制劑。卵黃抗體具有特異性，針對性，無耐藥性，安全，制備簡單，穩定性好，耐熱、耐酸，耐堿，抗離子強度，并具有一定抗酶解能力，且無殘留等優點，已成為了疫苗研究的熱點。研究表明，IgY能夠抵抗幼齡動物腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。家禽免疫系統的特性決定小劑量的抗原便可發揮作用，因此可以用少量抗原在較長時間獲得大量高滴度特異性抗體。一個母雞每年大約能產280枚雞蛋，每個卵黃里面含有100~150mgIgY，因此每只雞每年能夠產生40g特異性卵黃抗體，具有很大的生產潛力。因此，與其他哺乳動物制備多克隆抗體相比，特異性IgY制備有著經濟、易操作、產量大等優點。卵黃抗體與初乳中母源抗體的作用機理相似，都是以被動免疫的方式使幼畜獲得免疫力，達到保護幼畜的目的。因此研制抗牛支原體病的卵黃抗體，用于牛支原體病的防制具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術目的在于研制一種特異性卵黃抗體，它能預防牛支原體對奶牛的感染。該抗體的制備具有成本低，產量高、特異性強、操作簡單、對環境無污染等優點，是一種綠色的抗生素替代品。本專利技術通過以下技術方案實現：一種預防牛支原體的特異性卵黃抗體，是將滅活的牛支原體懸液與弗氏佐劑混合制成特異免疫原，用該免疫原免疫健康開產母雞，并收集其產的雞蛋，所述的雞蛋蛋黃中含有預防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體，其中所述的牛支原體菌株為NP2。制備預防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體的方法，其中制備特異免疫源的方法采用改良的Thiaucourt，s液體培養基，首先復活牛支原體（NP2）菌株，然后傳代培養3代達到菌濃度后擴大培養，再用0.4%甲醛滅活2~3h，離心制備成抗原懸液，然后與弗氏佐劑混合而成。所述的特異免疫原免疫健康產母雞，分離所產雞蛋的蛋黃，提取IgY，該雞蛋的蛋黃中含有所述的能夠預防奶牛牛支原體病的特異性卵黃抗體。所述的免疫產蛋母雞的免疫步驟是：在健康開產蛋雞的雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點注射500ul濃度為1mg/ml的用弗氏完全佐劑（FCA）混合的特異性免疫原，在基礎免疫后的15、30、45d后，同樣經雞雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點先后注射500ul、750ul、1ml濃度為2.0mg/ml的用弗氏不完全佐劑（FIA）混合的特異性免疫原。一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體，它被全卵黃粉作為抗生素的替代品用于飼料，預防牛支原體病。本專利技術細節由下列步驟所示：一、牛支原體抗原的制備1.培養牛支原體，測定菌體濃度牛支原體（NP2）菌株來自寧夏大學農學院臨床獸醫實驗室。菌株復活以后，按1%的接種量接種于改良的Thiaucourt，s液體培養基培養，于37℃震蕩培養2~3d。傳代培養至少傳3代。期間每隔2~3d采用顏色變化單位法（CCU）測定菌體濃度，要求達到109ccu/ml以上。2.牛支原體抗原的制備將達到指定菌濃度的菌液按1%的比例擴大培養，37℃振蕩培養4~5d，然后在菌液中加入終濃度為0.4%的甲醛，置于37℃的培養箱中滅活2~3d。收集滅活后的液體培養物，置于高速冷凍離心機離心，4℃、10000rpm/min離心30min，收集沉淀，沉淀用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸菌液，重復上述步驟3次。洗滌完成后用適量的PBS（磷酸鹽緩沖液）懸浮為牛支原體抗原懸液。抗原懸浮液進行無菌檢測，檢測合格后-20℃保存備用。3.牛支原體滅活疫苗的制備將制備好的牛支原體抗原逐滴加入等體積的弗氏佐劑（弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司），邊加邊振蕩使其充分混勻，完全乳化，制成油包水型油乳疫苗。疫苗抗原的最終濃度：弗氏完全佐劑混合的疫苗為1.0mg/ml，弗氏不完全佐劑混合的疫苗為2.0mg/ml。二、卵黃抗體的制備1.實驗動物和免疫免疫方式均為產蛋雞雙翼、胸腹部和背部皮下及肌肉多位點注射，共免疫四次。基礎免疫一次、加強免疫（二免、三免、四免）三次，間隔時間均為兩周。基礎免疫接種500ul濃度為1.0mg/ml的弗氏完全佐劑（FCA）混合的特異性免疫原，加強免疫（二免、三免、四免）分別接種500ul、750ul、1ml濃度為2.0mg/ml的弗氏不完全佐劑（FIA）混合的特異性免疫原。2.母雞抗體水平的監測首次免疫前一周開始每隔7天雞翅下靜脈采血液2ml，分離血清并做好標記，然后采用比利時Bio-XMycoplasambovisElisaKit試劑盒檢測抗體滴度，監測母雞抗體水平變化。待母雞體內抗體達到一定較高的穩定水平，收集雞蛋，編號標記后放入4℃冰箱內保存。3.雞蛋內抗體水平的評估1）卵黃的采集：卵黃先用酸化水稀釋法進行粗提。將卵黃與8倍體積的0.04mol/L檸檬酸緩沖液（PH5.2）稀釋，用磁力攪拌器攪拌均勻，分裝于離心管中4℃靜置過夜。然后以10000r/min低溫超速離心25min，收集上清經0.45μm濾膜過濾即獲得粗提卵黃抗體。2)卵黃抗體的純化：將粗提的卵黃抗體中加入飽和硫酸銨使其終濃度達到40%，混勻后4℃靜置5~8h，5000r/min離心25min，棄上清取沉淀，加適量滅菌超純水溶解；再加入飽和硫酸銨使其終濃度為60%，混勻后4℃本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體，其特征在于：它是以牛支原體滅活疫苗免疫健康產蛋雞，并收集被免疫雞所產的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有\牛支原體的特異性卵黃抗體。

【技術特征摘要】
1.一種預防牛支原體疾病的特異性卵黃抗體，其特征在于：它是以牛支原體滅活疫苗免疫健康產蛋雞，并收集被免疫雞所產的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有\牛支原體的特異性卵黃抗體。2.實現權利要求1產品的方法，其特征在于制備特異性免疫源的方法采用改良的Thiaucourt，s液體培養基將實驗室保存的M.bovis原菌株按1%進行增殖培養三代后，測定菌體濃度，當具有抗原性后用0.4%甲醛滅活制成抗原懸液，然后與弗氏佐劑混合制備成牛支原體滅活疫苗。3.權利要求2所述的方法，其特征在于，用制備的牛支原體滅活疫苗對非免疫產蛋母雞進行免疫注射，誘導免疫產蛋母雞產生抗牛支原體特異性抗體，然后分離蛋黃，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何生虎，曹思婷，郭亞男，
申請(專利權)人：寧夏大學，
類型：發明
國別省市：寧夏,64