The present invention provides a method for microbial microplate method for quantitative detection of pantothenic acid, which comprises the following steps: preparation and activation after Lactobacillus plantarum strain inoculation, then adding trehalose / sucrose and calcium chloride mixed liquid into the test bacteria; then the bacteria liquid is added to the hole plate test. In the test liquid heating in low vacuum condition, finally drying. The invention also provides a kit containing the microporous plate and a preparation method thereof. By adding trehalose / sucrose and calcium chloride mixed agent in the preparation, as well as improving the drying method of the bacterial liquid, the invention can reduce the loss of bacteria in the reagent box and improve the accuracy of the detection result of the pantothenic acid. The viable count, active bacteria species preservation of Lactobacillus plantarum the method for drying the foam plates prepared in more than the total number of bacteria bacteria added 92% (normal freeze drying loss of at least about 23% species).
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種用于微生物法定量檢測泛酸的微孔板、其試劑盒及其制備方法
本專利技術(shù)涉及一種用于微生物法定量檢測泛酸的微孔板、其試劑盒及其制備方法，屬于微生物法檢測領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
目前，國內(nèi)外關(guān)于泛酸的檢測方法都比較復(fù)雜，一般有微生物法、高效液相法和酶聯(lián)免疫法。其中，高效液相法檢測的下限較微生物法要高出很多，精度較好，但是需要昂貴的精密儀器和試劑，樣品處理過程較為復(fù)雜，難以在生產(chǎn)上進(jìn)行推廣應(yīng)用；另外，酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果與實(shí)際數(shù)值出入較大。而微生物法可靈敏地檢測出具有生物活性的泛酸，這是微生物法區(qū)別于其他方法的最大特點(diǎn)及優(yōu)勢?，F(xiàn)有的微生物方法利用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對泛酸的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中泛酸的含量。在測定用培養(yǎng)基中供給除泛酸以外的所有營養(yǎng)成分，這樣微生物生長產(chǎn)生的透光率就會同標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液及未知待測溶液中泛酸的含量相對應(yīng)；以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率相對于各濃度水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出試樣中泛酸的含量。但是包被有植物乳桿菌的試劑盒卻存在諸多缺陷，現(xiàn)有方法在-80℃使微孔板中的微生物懸浮液冷凍休眠，然后將微孔板中的微生物團(tuán)在真空下冷凍干燥。一些微生物為了適應(yīng)不利環(huán)境，發(fā)生變異或重組，因此加入水或樣品后，有些微生物在無維生素的條件下仍能生長，導(dǎo)致高檢測背景，而且在個別情況下還會導(dǎo)致錯誤結(jié)果。另外，現(xiàn)有方法采用在真空下冷凍干燥，還可導(dǎo)致至少約23％的菌種損失。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)微生物方法利用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對泛酸檢測的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服上述現(xiàn)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于微生物法定量檢測泛酸的微孔板，其特征在于，其由如下步驟制備而成：1)活化植物乳桿菌，將活化后的植物乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養(yǎng)基中，34?40℃培養(yǎng)18?24h，1900?2100轉(zhuǎn)/min離心2?3min，棄去上清液；2)加入7?10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2?3min，棄去上清液，重復(fù)前述操作一次，然后再加入7?10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1?2ml菌懸液至7?10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；3)將所述測試菌液2?6μl添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環(huán)境下加熱測試菌液，使測試菌液在30?35℃的溫度條件下沸騰而產(chǎn)生泡沫，并在所述低真空環(huán)境和室溫下蒸發(fā)干燥24?36h，或者冷凍后再以升華的方式干燥24?36h。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于微生物法定量檢測泛酸的微孔板，其特征在于，其由如下步驟制備而成：1)活化植物乳桿菌，將活化后的植物乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養(yǎng)基中，34-40℃培養(yǎng)18-24h，1900-2100轉(zhuǎn)/min離心2-3min，棄去上清液；2)加入7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2-3min，棄去上清液，重復(fù)前述操作一次，然后再加入7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1-2ml菌懸液至7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；3)將所述測試菌液2-6μl添加至微孔板各孔中，分別在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空環(huán)境下加熱測試菌液，使測試菌液在30-35℃的溫度條件下沸騰而產(chǎn)生泡沫，并在所述低真空環(huán)境和室溫下蒸發(fā)干燥24-36h，或者冷凍后再以升華的方式干燥24-36h。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔板，其特征在于，步驟1)中的活化植物乳桿菌采用活化方式為：將11g脫脂奶粉加入89ml蒸餾水中，混勻，115℃滅菌15分鐘，即為液體培養(yǎng)基；將0.1-0.4g粉末植物乳桿菌菌株加入10ml所述液體培養(yǎng)基中，34-38℃培養(yǎng)直至凝乳，得凝乳狀菌種，放置于0-4℃保存；將0.1-0.4ml上步驟中培養(yǎng)好的凝乳狀菌種加入10ml所述液體培養(yǎng)基中，34-38℃培養(yǎng)直至凝乳；重復(fù)幾次上一步驟，不同的是每次使用的菌種均是上一步驟獲得的培養(yǎng)物，待凝乳時間穩(wěn)定后表明菌種已活化好。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述植物乳桿菌菌株為植物乳桿菌ATCC8014。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔板，其特征在于，步驟2)中海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，各自的濃度分別為190-200mM、7-10mM。5.制備權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述微孔板的方法，其由如下步驟制備而成：1)活化植物乳桿菌，將活化后的植物乳桿菌菌株接種到乳桿菌肉湯培養(yǎng)基中，34-40℃培養(yǎng)18-24h，1900-2100轉(zhuǎn)/min離心2-3min，棄去上清液；2)加入7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻后離心2-3min，棄去上清液，重復(fù)前述操作一次，然后再加入7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液，混勻，制得菌懸液；吸1-2ml菌懸液至7-10ml海藻糖/蔗糖和氯化鈣混合液中，混勻制成測試菌液；3)將所述測試菌液2-6μl添加至微孔板各孔中，分別...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉龍飛，高天壘，卜慶婧，
申請(專利權(quán))人：北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11
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