本發明專利技術提供了一種大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，包括酶標板、酶標記的抗抗體、大觀霉素標準品、底物顯色液、終止液、洗滌液、大觀霉素抗體，所述酶標板上包被有大觀霉素半抗原?卵清蛋白偶聯物。本發明專利技術還公開了一種用上述酶聯免疫檢測試劑盒檢測牛奶中大觀霉素的方法，首先處理待測牛奶樣品，然后用酶聯免疫檢測試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發明專利技術提供的酶聯免疫檢測試劑盒，結構簡單、使用方便、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品定性、定量的檢測。
ELISA kit for spectinomycin and its use
The present invention provides a kind of spectinomycin ELISA kit, including ELISA plate, enzyme labeled antibody, spectinomycin standard, chromogenic substrate solution and stop solution, washing liquid, spectinomycin antibody, the ELISA plate coated with spectinomycin half ovalbumin antigen conjugates. The invention also discloses a method for a grand with the ELISA kit for detection of vancomycin in milk, milk processing sample first, and then were detected by ELISA kit, and analyzing the test result. The ELISA kit provided by the invention has the advantages of simple structure, convenient use, portability, high efficiency, accuracy, simplicity and suitability for the qualitative and quantitative detection of a large number of samples.
【技術實現步驟摘要】
大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒及其應用
本專利技術涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，其特別適于牛奶中大觀霉素藥物殘留的檢測。技術背景大觀霉素為鏈霉菌所產生的一種氨基環醇類抗生素，是一新型特效專治淋病的抗生素。大觀霉素能阻止細菌細胞壁蛋白質的合成并能阻礙已合成蛋白質的釋放，被廣泛應用于獸醫學領域。由于大觀霉素具有強大的抑菌殺菌作用和能促進動物生長等作用，一些廠家在飼料中非法添加，同時養殖用戶又不遵守休藥期，導致牛奶中大觀霉素的殘留超標的現象越來越多，對人民的健康造成了極其嚴重的影響。鑒于此種狀況,各國政府和國際組織都開始對獸藥殘留實施愈來愈嚴格的監控措施。大觀霉素傳統的檢測方法有微生物檢定法，薄層色譜法，高效液相色譜法，氣相色譜法，超高效液相色譜一串聯質譜技術等，這些方法用于牛奶中的大觀霉素檢測，前處理繁瑣序復雜，測定周期長，甚至需要昂貴的儀器，成本較高，不能滿足牛奶樣品中大觀霉素的實時快速檢測。
技術實現思路
針對上述現有技術的不足，本專利技術提供了一種大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，其包括酶標板、酶標記抗抗體、大觀霉素標準品、底物顯色液、終止液、洗滌液、大觀霉素抗體，所述酶標板上包被有大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯物。所述大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯物由大觀霉素半抗原與卵清蛋白偶聯得到。所述大觀霉素半抗原由大觀霉素與羧甲基羥胺反應得到。所述大觀霉素抗體為大觀霉素單克隆抗體或大觀霉素多克隆抗體。所述大觀霉素抗體由大觀霉素半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白或血藍蛋白，所述大觀霉素半抗原為大觀霉素-羧甲基羥胺。所述大觀霉素標準品溶液的濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L。所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶，所述顯色底物液為顯色底物A液和顯色底物B液，所述顯色底物A液為過氧化脲，顯色底物B液為四甲基聯苯胺，終止液為2mol/L鹽酸。所述洗滌液為含有1.0-1.5％吐溫20和0.5‰Proclin300防腐劑的Tris緩沖液，所述百分比、千分比均為體積比。本專利技術的另一個目的還提供了一種應用上述大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒檢測牛奶樣品中大觀霉素殘留的方法，其主要包括：首先處理待測牛奶樣品；然后用上述大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒進行檢測；最后分析檢測結果。本專利技術大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中大觀霉素藥物的殘留量；對牛奶樣品的前處理要求不高，樣品前處理過程比較簡單，能同時快速檢測大批量牛奶樣品。本專利技術的酶聯免疫檢測試劑盒，本身結構簡單、使用方便、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品定性、定量的檢測。本專利技術的酶聯免疫檢測試劑盒可以在大觀霉素殘留檢測中發揮重要作用。附圖說明圖1：大觀霉素半抗原合成技術路線；圖2：大觀霉素標準品抑制曲線。具體實施方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本專利技術。這些實施例僅用于說明本專利技術，而不用來限制本專利技術的范圍。實施例1大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，其包括：1)96孔或48孔酶標板，其上包被大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯物；2)酶標記抗抗體，為用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；3)大觀霉素標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L；4)底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯苯胺；5)終止液為2mol/L鹽酸；6)洗滌液為含有1.0％～1.5％吐溫20(百分比為體積比)和0.5‰Proclin300的Tris緩沖液(千分比為體積比)；7)大觀霉素抗體，為大觀霉素單克隆抗體。實施例2酶聯免疫檢測試劑盒主要成分的制備1、免疫原和包被原合成免疫原合成包括兩步，第一步將大觀霉素與羧甲基羥胺反應合成大觀霉素半抗原，第二步將大觀霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原。1)大觀霉素半抗原的合成，路線圖見圖1稱取100mg大觀霉素和140mg羧甲基羥胺溶于3mL吡啶中，室溫攪拌24小時，吹干，加水10mL，用0.2mol/LNaOH調至pH9左右，用CH2Cl2提取3次,每次20mL，棄CH2Cl2，水層用HCl調至pH3,再用CH2Cl2提取3次，每次20mL，用無水硫酸鈉脫水，過濾，將濾液在45℃下吹干，60℃烘干3小時，得白色晶體，即為大觀霉素半抗原。2)免疫原合成稱取50mg大觀霉素半抗原，加2mL二氧六環，30μL三正丁胺，30μL氯甲酸異丁酯，在10℃攪拌1h，將反應液倒入牛血清白蛋白(160mg牛血清白蛋白溶于5mLH2O和5mL二氧六環)，用NaOH調至pH8.5，再在10℃下攪拌6h。以流動的蒸餾水在4℃下透析24h，透析液經冷凍干燥，得到免疫原。3)包被原合成用大觀霉素半抗原與卵清蛋白偶聯得到，方法同免疫原合成。2、單克隆抗體的制備1)動物免疫挑選8周齡的Balb/c小鼠，用含有氟氏完全佐劑的免疫原及大觀霉素半抗原-牛血清白蛋白偶聯物進行皮下注射，免疫劑量為150μg/只，每2周加強免疫一次，第4次加強免疫后一周，得到效價為1:1000的抗體血清。2)骨髓瘤細胞和脾細胞的制備SP2/0骨髓瘤細胞采用常規的RPMI-1640培養液培養，使細胞處于對數生長期，制成SP2/0骨髓瘤細胞細胞懸液；取經免疫的小鼠脾臟，破碎，過400目的不銹鋼紗布過濾制成脾細胞懸液，計數后備用。3)細胞融合和單克隆化將1×108SP2/0骨髓瘤細胞和5×108脾細胞在PEG作用下進行融合，對于分泌抗體培養孔，采用間接競爭ELISA測定以篩選陽性孔。采用有限稀釋法對陽性孔進行單克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。該抗體特異性是針對大觀霉素的，靈敏度能達到0.05μg/L。4)細胞凍存和復蘇將大觀霉素的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成(1-2)×106個/mL的細胞懸液，每個凍存管1mL，采用逐漸降溫法保存在液氮中。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，然后移至冰上5min，再轉入錐形瓶中，加入10mL溫熱的完全培養液中，移入CO2培養箱中培養。5)單克隆抗體的大量生產與純化取健康的Balb/c雌鼠，腹腔注入降植烷0.5mL/只，7天后腹腔注射大觀霉素的單克隆雜交瘤細胞株3×105個/只，隔天觀察，10-20天后采集腹水。先用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水初步純化，后采用裝有Protein-A柱子的AKTApurifier100純化儀進行純化，純化后抗體-20℃保存。3、羊抗鼠抗抗體制備：是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、酶標記羊抗鼠抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物物酶(HRP)采用馬來酰亞胺基類活潑酯法進行偶聯。1)采用4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)活化辣根過氧化物物酶，取100μL約10mg/mL的HRP溶液，按SMCC：ALP摩爾投料比(3～5):1加入SMCC，25℃反應30min后，用G25脫鹽本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，包括酶標板、酶標記抗抗體、大觀霉素標準品、底物顯色液、終止液、洗滌液、大觀霉素抗體，所述酶標板上包被有大觀霉素半抗原?卵清蛋白偶聯物。
【技術特征摘要】
1.一種大觀霉素藥物的酶聯免疫檢測試劑盒，包括酶標板、酶標記抗抗體、大觀霉素標準品、底物顯色液、終止液、洗滌液、大觀霉素抗體，所述酶標板上包被有大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯物。2.如權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述大觀霉素半抗原-卵清蛋白偶聯物由大觀霉素半抗原與卵清蛋白偶聯得到。3.如權利要求1或2所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述大觀霉素半抗原由大觀霉素與羧甲基羥胺反應得到。4.如權利要求3所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述大觀霉素抗體為大觀霉素單克隆抗體或大觀霉素多克隆抗體。5.如權利要求4所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述大觀霉素抗體由大觀霉素半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白或血藍蛋白，所述大觀霉素半抗原為大觀霉素-羧甲基羥胺。6.如權利要求1或2所述的酶...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊紹元，楊少瓊，
申請(專利權)人：云南輝瑞貝爾生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：云南,53
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