PH調(diào)整以改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇制造技術(shù)

本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在具有約6.7至約8.5的pH的冷凍培養(yǎng)基中冷凍哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

PH was adjusted to improve the thawing recovery of the cell bank

The present invention provides methods for freezing, storing, or improving the thawing recovery of a cell bank, comprising freezing mammalian cells in a frozen medium having a 6.7 to about 8.5 pH.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】PH調(diào)整以改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年7月9日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/022,392的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
本專利技術(shù)涉及冷凍細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的方法，用于在冷凍細(xì)胞中使用的建庫(banking)和冷凍介質(zhì)。
技術(shù)介紹
通過首先在分批/灌注細(xì)胞培養(yǎng)方法中積累細(xì)胞、然后收獲細(xì)胞用于建庫來產(chǎn)生細(xì)胞庫。該方法包括三個(gè)階段：細(xì)胞積累、收獲和細(xì)胞濃縮、以及細(xì)胞建庫。收獲方法步驟用于濃縮最終的細(xì)胞培養(yǎng)液或使用離心從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取細(xì)胞。隨后的匯集和填充方法用于制備用于長期儲(chǔ)存的細(xì)胞庫安瓿。這些傳統(tǒng)方法可能導(dǎo)致選定細(xì)胞系解凍后不一致或差的生存力。細(xì)胞建庫方法必要的是在解凍冷凍細(xì)胞后需要高的細(xì)胞生存力。因此，改進(jìn)的用于細(xì)胞建庫的冷凍細(xì)胞的方法是期待的。在建庫后解凍時(shí)允許更大細(xì)胞生存力的用于冷凍細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基將是有益的。本文中出于所有目的引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過引用整體并入本文。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
一方面，本文提供了一種改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于建庫的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH。在另一方面，本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍細(xì)胞，其中冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH或在冷凍之前已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8或約7.5的pH。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，冷凍培養(yǎng)基的pH已經(jīng)調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5、約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在pH調(diào)節(jié)之前和/或之后將細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH之前測(cè)量含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括測(cè)量調(diào)節(jié)的冷凍培養(yǎng)基的pH的步驟。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則所述方法包括重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到調(diào)節(jié)的冷凍培養(yǎng)基的pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在本文或上文所述方法的一些實(shí)施方案中，通過加入堿來調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V堿＝C堿*Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C堿是堿特異性系數(shù)，V堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿的體積，Vp是冷凍培養(yǎng)基的體積，pHt是目標(biāo)pH，pHi是初始pH。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入碳酸鈉調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷凍培養(yǎng)基中的1M碳酸鈉的體積，Vp是冷凍培養(yǎng)基的體積，pHt是目標(biāo)pH，pHi是初始pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH是介于約6.7至約8.5之間、約7.2至約8.3之間或本文所述的任何pH或任何pH范圍內(nèi)的pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為7.5。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前，細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)在pH約6.2至約6.6的培養(yǎng)基中。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，低溫防護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其組合。在一些實(shí)施方案中，冷凍之前冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計(jì)。在一些實(shí)施方案中，冷凍細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)之前冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計(jì)。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基在冷凍前具有約8％至約28％的收集細(xì)胞體積(packedcellvolume)(PCV)的細(xì)胞密度。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)與冷凍培養(yǎng)基組合之前、在細(xì)胞收獲和濃縮過程中冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。在另一方面，本文提供了冷凍用于儲(chǔ)存的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)或改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括(a)將含有細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至pH約6.7至約8.5，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；和(b)冷凍細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，將pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.3、約6.8至約8.3、約6.9至約8.3、約7.0至約8.3、約7.1至約8.3、約7.2至約8.3、約7.3至約8.3、約7.4至約8.3、約7.5至約8.3、約7.2至約8.0、約7.2至約7.8、或約7.5。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)pH為約7.5。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量pH為約6.7至約8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH之前測(cè)量含有細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH的步驟。在一些實(shí)施方案中，如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則該方法包括重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH為約6.7至約8.5、約7.2至約8.3、或本文所述的任何pH或任何pH范圍。在上文或本文所述方法的一些實(shí)施方案中，通過加入堿來調(diào)節(jié)pH。在一些實(shí)施方案中，堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)下式V堿＝C堿*Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C堿是堿特異性系數(shù)，V堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于建庫的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.07.09 US 62/022,3921.一種改善細(xì)胞庫的解凍復(fù)蘇的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍用于建庫的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。2.一種冷凍用于儲(chǔ)存的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括在冷凍培養(yǎng)基中冷凍哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑，并且其中所述冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.5的pH。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約6.7至約8.3、約7.2至約7.8或約7.5的pH。4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述冷凍培養(yǎng)基的pH已調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述冷凍培養(yǎng)基的pH已調(diào)節(jié)至約6.7至約8.3或約7.2至約7.8的pH。6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述冷凍培養(yǎng)基的pH已調(diào)節(jié)至約7.5的pH。7.如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在pH調(diào)節(jié)之前和/或之后將細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合。8.如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述目標(biāo)pH為約6.7至約8.3。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述測(cè)量pH為約6.7至約8.3。11.如權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括在調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH之前測(cè)量包含細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。12.如權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH的步驟。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟，直到冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH為約6.7至約8.3。14.如權(quán)利要求4-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過加入堿調(diào)節(jié)pH。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中根據(jù)下式V堿＝C堿*Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C堿是堿特異性系數(shù)，V堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿的體積，Vp是冷凍培養(yǎng)基的體積，pHt是目標(biāo)pH，pHi是初始pH。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中根據(jù)下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入碳酸鈉調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷凍培養(yǎng)基中的1M碳酸鈉的體積，Vp是冷凍培養(yǎng)基的體積，pHt是目標(biāo)pH，pHi是初始pH。18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中目標(biāo)pH為6.7至8.3、7.2至7.8或7.5。19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在具有pH為約6.2至約6.6的培養(yǎng)基中。20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中低溫防護(hù)劑是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇或糖。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中低溫防護(hù)劑是DMSO或甘油，并且在冷凍之前冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約12.5％，以體積計(jì)。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中在冷凍細(xì)胞之前，冷凍培養(yǎng)基中的DMSO或甘油的濃度為約5％至約10％，以體積計(jì)。23.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基在冷凍之前具有約8％至約28％收集細(xì)胞體積(PCV)的細(xì)胞密度。24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞與冷凍培養(yǎng)基組合之前、在細(xì)胞收獲和濃縮過程中冷卻細(xì)胞培養(yǎng)液的步驟。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約20℃的溫度。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中將細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至等于或低于約10℃的溫度。27.一種冷凍用于儲(chǔ)存的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)將含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.5的pH，其中所述冷凍培養(yǎng)基包含緩沖溶液和低溫防護(hù)劑；和(b)冷凍哺乳動(dòng)物細(xì)胞。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中將pH調(diào)節(jié)至約6.7至約8.3或約7.2至約7.8的pH。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中將pH調(diào)節(jié)至約7.5的pH。30.如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中調(diào)節(jié)的pH是目標(biāo)pH或測(cè)量pH。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述目標(biāo)pH為約6.7至約8.3。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中測(cè)量pH為約6.7至約8.3。33.如權(quán)利要求27所述的方法，所述方法在調(diào)節(jié)所述冷凍培養(yǎng)基的pH之前還包括測(cè)量包含細(xì)胞的冷凍培養(yǎng)基的初始pH的步驟。34.如權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括測(cè)量冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH的步驟。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中如果冷凍培養(yǎng)基的測(cè)量pH低于目標(biāo)pH，則重復(fù)調(diào)節(jié)步驟和測(cè)量步驟直到冷凍培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)pH為約6.7至約8.5。36.如權(quán)利要求27-35中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過加入堿調(diào)節(jié)pH。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述堿選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES鈉鹽、氫氧化鈉和氫氧化鉀。38.如權(quán)利要求36或37所述的方法，其中根據(jù)下式V堿＝C堿*Vp(pHt-pHi)通過向冷凍培養(yǎng)基中加入堿調(diào)節(jié)冷凍培養(yǎng)基的pH，其中C堿是堿特異性系數(shù)，V堿是加入到冷凍培養(yǎng)基中的堿的體積，Vp是冷凍培養(yǎng)基的體積，pHt是目標(biāo)pH，pHi是初始pH。39.如權(quán)利要求36或37所述的方法，其中根據(jù)下式VNa2CO3＝0.0085V...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：A·邁耶，S·J·邁耶，P·杜菲，M·科因，K·卡爾霍恩，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：豪夫邁·羅氏有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士,CH