檢測樣品中多種核苷酸的方法技術

本發明專利技術涉及測定樣品中多種核苷酸的存在和/或存在數量的方法。

Method for detecting a plurality of nucleotides in a sample

The present invention relates to a method for determining the presence and / or presence of a plurality of nucleotides in a sample.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】檢測樣品中多種核苷酸的方法
本專利技術涉及樣品中多種核苷酸的存在和/或存在數量的測定方法知識背景實時PCR可以連續進行PCR產物的產生過程中的標記的監測。目前，可用的方法為利用標記的探針或DNA嵌入染料來監控PCR產物的擴增。為了這個目的，可以利用含有熒光團和例如相距10-30個堿基的淬滅劑的單寡核苷酸探針。由于Taq聚合酶的5'-3'雙鏈特異性核苷酸外切酶活性，這樣的TaqMan探針可以在擴增期間被水解，把從所述熒光團從淬滅劑上分離，導致熒光增加。通常使用的實時PCR儀器配備有熒光檢測器和軟件能夠估計循環閾指示值(Ct)，在這個循環中熒光比背景熒光更大的，為陽性反應。然而，公認的難點在于已公布檢測結果的不可重復性，由于PCR熱循環性能的多變性，不同DNA聚合酶的低效，個人原因和在樣品基質中存在的PCR抑制劑都可以妨礙實驗室的實施，特別是那些具有廣泛的質量保證程序。缺乏可重復的方法，常常迫使檢測實驗室花費大量資源適應已公布的測定結果。因此，有必要具有國際認可的，基于公開配方的可獲得的PCR方法，其靶基因，運行特性和驗證標準都是公知的，而且為了替代微生物方法驗證遵循ISO標準。一些已公布的PCR程序的一個主要缺點是不包含內部擴增對照。對比(外部)陽性對照，內部擴增對照是在非常相同的樣品中的不存在靶DNA序列，它可以與靶序列共同擴增。在一個沒有內部擴增對照PCR中，陰性反應(無條帶或信號)可能意味著在反應中沒有靶序列的存在。但是，因為熱循環儀故障，不正確的PCR混合物，DNA聚合酶失活，或特別是樣品基質中存在抑制物，它也可能意味著該反應被抑制。特別是，提取核苷酸之后，仍可能存在來自臨床樣品(例如血紅蛋白)、環境樣品(例如，腐殖酸和富里酸)和核苷酸提取(例如乙醇洗滌劑，或離液劑)期間采用的化學品的抑制劑。當PCR受擴增抑制劑影響時，從假陰性中區分真陰性結果是可以實現的。通過含有能指示PCR抑制劑的存在和影響的內部核苷酸對照，可以增加診斷測定法的可靠性。內部陽性對照通常與存在的靶序列被同時擴增，其標記的熒光團可以產生與測定靶序列使用的熒光不同波長的熒光，兩種不同頻道的熒光被實時PCR測定儀檢測到。PCR常用的內部對照是質粒，該質粒包含與測定靶標類似的序列，除了探針區域。有限數量的內部陽性對照分子可被加入到單獨的靶標測定中并與靶核苷酸共同擴增。因此，內部陽性對照信號是把極少量的靶標核苷酸進行充分擴增到足以產生陽性信號的證據。但是，一些設備如LightCycler1.2和LightCycler2(羅氏應用科學，印第安納波利斯，美國)，加固高級病原鑒定設備儀(R.A.P.I.D.)(愛達荷州技術，鹽湖城，猶他州，美國)，以及手持式實時PCR儀僅配備了一個光源和相關的排放或者發射通道。為了克服這一缺陷，P.Jothikumar等(BioTechniques46：519524(2009))設計創建了一個三重標記探針作為內部陽性對照(IPC)，其采用熒光共振能量轉移(FRET)和TaqMan技術的組合。IPC探針，5'端用FAM和Cy5.5熒光標記，在3'端用黑洞猝滅劑(BlackHoleQuencher，BHQ)標記，通過來自FAM熒光的能量轉移使的Cy5.5發光。第二，在多重通道的靶標特異的TaqMan測定中分別利用5'和3'末端的FAM和BHQ1標記的探針。因此，一個激發源被用來產生兩種不同的熒光(FAM和Cy5,5)，可以被實時PCR儀中的兩個獨立的通道檢測到。Rosenstraus等(Rosenstrausetal.,JournalofClinicalMicrobiology,36,191-197(1998))描述了用于常規診斷性PCR的內部對照，其中利用單獨的，靶子特異的和內部對照特異的寡核苷酸捕捉探針，特定靶標和內部對照在各自的反應中被檢測到。Gruber等(Gruberetal.,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,67,2837-2839(2001))描述了定量病毒DNA的實時PCR方法包括雙重擴增，內標，以及雙色熒光檢測，而不需要產生外部標準化曲線。然而，在本領域仍舊需要檢測多種核苷酸的適當的方法，例如樣品中的靶標核苷酸和內部對照核苷酸。
技術實現思路
本專利技術涉及一些測定例如樣品中多種被分析物的測定。在一方面，檢測樣品中核苷酸存在和/或存在的數量的方法包括:(a)提供一定數量的第一核苷酸；一定數量的第二核苷酸；一定數量FRET化合物，其可以與第一核苷酸形成復合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結合區域，和第一可檢測標記，其在未復合的狀態時為第一可檢測特征，在復合狀態時，為不同于第一可檢測特征的第二可檢測特征；一定數量的報告化合物，可以與第二核苷酸形成復合物，其中每一個報告化合物包括與第二核苷酸特異的結合區域和第二可檢測標記；并且能夠捕捉報告化合物的結合成員；其中第二核苷酸與報告化合物形成的復合物抑制了結合成員對報告化合物的捕捉；(b)形成復合物，每一個形成的復合物包括一個第一核苷酸和一個FRET化合物；(c)一定數量的報告化合物子集與一個第二核苷酸形成復合物；(d)捕捉剩余的未與結合成員上的第二核苷酸復合的報告化合物的子集；(e)測定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值；(f)測定結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值。該方法進一步包括測定第二核苷酸存在和/或存在數量的指示值，該指示值的測定是基于結合成員上捕捉的報告化合物存在和/或存在數量的指示值。在一些實施例中，FRET化合物的第一和/或第二可檢測標記是熒光標記。特別的，第一可檢測標記和第二可檢測標記釋放的光譜范圍都為300nm至850nm，例如450nm至750nm或550nm至650nm。在一個實例中，第一可檢測標記和第二可檢測標記是完全相同的。被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值可以用復合狀態的FRET化合物被檢測到。另外，第一核苷酸可以是一種被分析物，例如一種第一被分析物。第二核苷酸可以從被分析物的組合中選取，例如第二被分析物，和對照核苷酸。對照核苷酸可以從陽性擴增對照和陰性擴增對照中選擇。在一些實施例中，每個樣品中第一核苷酸的存在數量可以少于100個拷貝數。另外或可選擇的，每個樣品中第二核苷酸的存在數量可以是100個拷貝數或更多。進一步，以下步驟是可以同時進行的，(i)每一個形成的復合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ii)一定數量的報告化合物子集和至少一定數量的第二核苷酸子集組成復合物，(iii)捕捉剩余的未與結合成員上的第二核苷酸復合的一定數量的報告化合物的子集。根據另一實施例，該方法還包括以所述第一和/或第二核苷酸為目標進行擴增。或者，如在以第一和/或第二核苷酸為目標進行循環擴增反應的情況下，核苷酸在一定數量的報告化合物的子集和至少一定數量的第二核苷酸形成復合物的步驟之前，第一和第二核苷酸的擴增被啟動。此外，如在第一和/或第二核苷酸進行等溫擴增反應的情況下，以下步驟可以同時進行，(i)每一個形成的復合物包括第一核苷酸和FRET化合物，(ⅱ)一定數量的報告化合物的子集和至少一定數量的第二核苷酸形成復合物，(ⅲ)捕捉剩本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測樣品中核苷酸的存在和/或存在數量的方法包括(a)提供一定數量的第一核苷酸；一定數量的第二核苷酸；一定數量的能與第一核苷酸形成復合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結合域，和第一可檢測標記，其可以處于一種未復合狀態，即第一可檢測特征，以及處于一種復合狀態，即第二可檢測特征；一定數量的能與第二核苷酸形成復合物的報告化合物，其中每一個報告化合物包括第二核苷酸特異的結合域和第二可檢測標記；結合成員能捕捉報告化合物；其中第二核苷酸與報告化合物形成的復合物抑制了結合成員對報告化合物的捕捉；(b)以第一和/或第二核苷酸為目標進行擴增；(c)每一個形成的復合物包括一個第一核苷酸和一個FRET化合物；(d)一定數量的報告化合物子集與一個第二核苷酸形成復合物；(e)捕捉未與結合成員上的第二核苷酸形成復合物的剩余的一定數量的報告化合物子集；(f)測定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值；(g)測定表示結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.02.21 GB 1403076.11.檢測樣品中核苷酸的存在和/或存在數量的方法包括(a)提供一定數量的第一核苷酸；一定數量的第二核苷酸；一定數量的能與第一核苷酸形成復合物的FRET化合物，其中FRET化合物包括第一核苷酸特異的結合域，和第一可檢測標記，其可以處于一種未復合狀態，即第一可檢測特征，以及處于一種復合狀態，即第二可檢測特征；一定數量的能與第二核苷酸形成復合物的報告化合物，其中每一個報告化合物包括第二核苷酸特異的結合域和第二可檢測標記；結合成員能捕捉報告化合物；其中第二核苷酸與報告化合物形成的復合物抑制了結合成員對報告化合物的捕捉；(b)以第一和/或第二核苷酸為目標進行擴增；(c)每一個形成的復合物包括一個第一核苷酸和一個FRET化合物；(d)一定數量的報告化合物子集與一個第二核苷酸形成復合物；(e)捕捉未與結合成員上的第二核苷酸形成復合物的剩余的一定數量的報告化合物子集；(f)測定被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值；(g)測定表示結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值。2.在權利要求1所述的方法中，進一步包括基于結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值，測定表示第二核苷酸的存在和/或存在數量的指示值。3.在權利要求1或2所述的方法中，其中第一可檢測標記是一種熒光標記。4.在權利要求1至3所述的方法中，其中第二可檢測標記是一種熒光標記。5.在權利要求1至4所述的方法中，其中第一可檢測標記和第二可檢測標記都是熒光標記。6.在權利要求5所述的方法中，其中第一可檢測標記和第二可檢測標記發射的波長范圍為300nm至850nm。7.在權利要求5或6所述的方法中，其中第一可檢測標記和第二可檢測標記是完全相同的。8.在權利要求1至7所述的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值是在FRET化合物處于復合狀態時被測定的。9.在權利要求1至8所述的任意方法中，其中第一核苷酸是一種被分析物。10.在權利要求1至9所述的任意方法中，其中第二核苷酸選自第二被分析物和對照核苷酸。11.在權利要求1至10所述的任意方法中，其中每個樣品中第一核苷酸的存在數量不少于100個拷貝。12.在權利要求1至11所述的任意方法中，其中每個樣品中第二核苷酸的存在數量為100個拷貝或更多。13.在權利要求1至12所述的任意方法中，其中以下步驟是可以同時進行的，(i)每一個形成的復合物中包括一個第一核苷酸和一個FRET化合物，(ii)一定數量的報告化合物子集與至少一定數量的第二核苷酸子集形成復合物，(iii)捕捉剩余的未與結合成員上的第二核苷酸復合的一定數量的報告化合物子集。14.在權利要求1至13所述的任意方法中，其中在一定數量的報告化合物子集與至少一定數量的第二核苷酸子集形成復合物之前，第一和第二核苷酸的擴增被啟動。15.在權利要求1至13所述的任意方法中，其中以下步驟是同時進行的，這些步驟為(i)每一個形成的復合物中包括一個第一核苷酸和一個FRET化合物，(ii)一定數量的報告化合物子集與至少一定數量的第二核苷酸子集形成復合物，(iii)捕捉剩余的未與結合成員上的第二核苷酸復合的一定數量的報告化合物子集，(iv)以第一和/或第二核苷酸為目標進行擴增。16.在權利要求14或15所述的方法中，其中第二核苷酸選自陽性擴增對照和陰性擴增對照。17.在權利要求1至16所述的任意方法中，其中結合成員包括一個或多個不同的報告特異捕捉化合物，其能捕捉結合成員上的報告化合物。18.在權利要求17所述的方法中，其中報告特異捕捉化合物是寡核苷酸。19.在權利要求17和18所述的方法中，其中不同的報告特異捕捉化合物被排列與結合成員相關的不同位置。20.在權利要求17至19所述的任意方法中，其中通過與報告特異捕捉化合物形成復合物，報告化合物在結合成員是被捕捉。21.在權利要求17至20所述的任意方法中，其中能與第一核苷酸形成復合物的報告化合物，至少它的部分互作位點也能與報告特異捕捉化合物形成復合物。22.在權利要求17至21所述的任意方法中，其中報告特異捕捉化合物和第二核苷酸競爭與報告化合物形成復合物。23.在權利要求1至22所述的任意方法中，其中表示被FRET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值，和/或表示結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值是在含有結合成員和蓋元件的反應室被測定的，其中可選擇的蓋元件被配制為至少部分可變形的，那樣反應室具有松弛狀態的內部體積和壓縮狀態的內部體積。24.在權利要求1至22所述的任意方法中，其中表示被FTET化合物捕捉的第一核苷酸的存在和/或存在數量的指示值，和/或表示結合成員上捕捉的報告化合物的存在和/或存在數量的指示值是在反應室被測定的，該反應室含有第一表面、第二表面和能捕捉報告化合物的結合成員，其中第一和第二表面間的距離是可變的，那樣反應室具有松弛狀態的內部體積和壓縮狀態的內部體積。25.在權利要求24所述的方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：烏利奇·托馬斯，
申請(專利權)人：美艾利爾技術公司，
類型：發明
國別省市：德國,DE