抗-恒河猴D重組多克隆抗體和生產方法技術

本發明專利技術涉及用于生產抗－ＲｈＤ重組多克隆抗體組合物（抗－ＲｈＤｒｐＡｂ）的方法所述方法包括獲得用抗－ＲｈＤ抗體表達載體轉染的細胞的集合，其中在所述集合中的每個細胞能從包含Ｖ↓［Ｈ］和Ｖ↓［Ｌ］的核酸片段表達文庫的一個成員，所述的文庫成員編碼抗－ＲｈＤ重組多克隆抗體組合物的一個獨特成員并且其位于所述集合中的單獨細胞的基因組中的相同位點。將所述細胞在適合表達所述重組多克隆抗體的條件下培養，所述抗體從細胞或培養物上清液獲得。通過用用于位點特異性整合的載體文庫轉染細胞而將編碼抗－ＲｈＤ　　ｒｐＡｂ的核酸片段導入所述細胞中。本方法適于生產抗－ＲｈＤ　　ｒｐＡｂ，因而可以得到優于血漿來源的預防性和治療性免疫球蛋白產物的替代品。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術描述了抗-恒河猴D重組多克隆抗體(抗-RhD rpAb)的產生以及產生多克隆工作細胞庫的方法，所述的細胞庫用于隨后產生期望的多克隆抗體。本專利技術也涉及編碼抗-RhD rpAb的文庫并涉及產生抗-RhD rpAb的細胞系。此外，本申請案描述了包含抗-RhD rpAb的藥理學和診斷性組合物以及它們在預防新生兒溶血性疾病(HDN)、治療特發性血小板減少性紫癜(ITP)和防止在錯誤地將RhD(+)血輸入至RhD(-)個體后對恒河猴D抗原的致敏作用的用途。
技術介紹
恒河猴血液群抗原位于跨膜紅血球蛋白，該跨膜紅血球蛋白包含所謂的C、c、E、e和D抗原。由于遺傳的多態性，大約16％的白種人為恒河猴D陰性(RhD(-))。而且，存在多種RhD的遺傳和血清學變體(分為類型II-VII)，其中RhDVI是與臨床最相關的。因為VI型陽性紅細胞(RBC)比其它類型的RBC攜帶較少的多種D蛋白表位，RhDVI(+)個體可以形成對抗來自其它RhD陽性(RhD(+))個體的RBC的同種抗體(Issitt，P.D.和Anstee，D.J.，1998.The Rh Blood GroupSystem，Montgomery Scientific Publications，Durham，NorthCarolina，pp.315-423)。{Issitt&Anstee 1998 11809/id}RhD陰性本身不與任何醫學情況相關，但當RhD(-)母體孕有RhD(+)或RhDVI(+)胎兒或RhDVI(+)母體孕有RhD(+)胎兒時具有重要的醫學關聯。如果嬰兒的紅細胞進入母體的循環系統中，通常是在圍產期(在分娩時)，則可能發生母嬰的RhD異源免疫，并因而引起母體抗-RhD抗體應答的誘導。在后來的妊娠中，母體的RhD-特異性IgG-分子將通過胎盤進入至胎兒的循環中并介導胎兒紅細胞的溶解，因而引起新生兒溶血性疾病(HDN)。據估計，平均20％第二次分娩RhD(+)嬰兒，并且沒有進行適當的抗-D預防的RhD(-)婦女，將產生抗-RhD抗體反應。當未處理時，大約30％的新生兒將患有中度的貧血癥、黃疸和肝腫大，并且20％發展為嚴重貧血癥和胎兒水腫，并且嚴重受影響的新生兒有新生兒死亡或永久性嚴重殘疾的危險。對抗RhD的多克隆免疫球蛋白制劑在世界范圍內用于預防懷孕的RhD(-)和RhDVI(+)婦女的異源免疫，因而防止新生兒的溶血性疾病。對抗RhD(抗-D)的多克隆免疫球蛋白制劑目前通過采集血漿獲得，所述的血漿從已經變得超免疫的供體獲得，其中超免疫是通過自然RhD異源免疫或通過用RhD陽性紅細胞接種RhD陰性自愿者而獲得的。用于預防HDN的抗-RhD免疫球蛋白制劑的效力是相當確定的并已經常規使用許多年。因而這種嚴重的疾病已經稀有發生。然而，這種疾病的根本起因，即懷孕的RhD(-)和RhDVI(+)婦女的異源免疫，仍然存在并因而需要不斷的供應抗-D免疫球蛋白制劑。除了預防HDN，抗-D免疫球蛋白也已證明可用于治療特發性血小板減少性紫癜(ITP)(George，J.N.，2002.Blood Rev.16，37-38)。ITP是血液疾病，其中自身抗體導致脾和肝中加速的血小板清除率。癥狀是血小板水平降低，導致瘀傷和流血。嚴重的情況時要將脾臟移除。然而由于嚴重的副作用這在嬰兒中是不可能的，因而需要備選的治療，如抗-D免疫球蛋白。而且，在錯誤地將RhD(+)血液輸注給RhD(-)受血者后使用抗-D免疫球蛋白以便防止對恒河猴D抗原的致敏作用。目前用于產生抗-D的方法，正如已經提到的，需要重復免疫日益難得到的一群供體用于產生高滴度抗血清。也存在相關的風險因素和技術問題，例如用于免疫的恒河猴陽性RBC的使用帶有傳播病毒病(例如乙型肝炎病毒、AIDS以及其它仍未知的病毒)的風險。而且，也存在批與批之間變化的問題。因而，需要一種備選的用于產生抗-RhD抗體的方法。首先發展了用于產生抗-RhD單克隆抗體的細胞方法作為超免疫血清的備選。這種技術包括用EB病毒轉化產生B類淋巴母細胞系的淋巴細胞(Crawford等1983.Lancet 1，386-8)。然而，這些細胞系不穩定并需要大量的克隆。通過雜交瘤技術產生人抗體也受限于缺少合適的人骨髓瘤融合伴侶(Kozbor，D.和Roder，J.C，1983.Immunol.Today.4，72)。作為這些技術的替代，發展了涉及VH和VL的全套克隆和噬菌體展示文庫的構建的分子方法(Barbas，CF.等，1991.Proc Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982)。噬菌體展示技術也可應用于分離恒河猴D抗原結合物。已經用這種方法分離了大量具有恒河猴D抗原結合特異性的單克隆抗體(mAbs)(WO 97/49809和Siegel，D.L等，2002.Transfus.Clin.Biol.9，83-97)。最近使用重組抗-RhDVImAb的臨床試驗已經顯示，有可能在用RhD(+)RBC大量攻擊后防止RhD免疫反應(Miescher，S.等，2004，Blood 103，4028-4035)。然而，該試驗也顯示，該mAb在有關RBC清除率上比抗-D免疫球蛋白效力低。這種降低的清除率的原因仍然未知。有可能是，一種單一抗體不能像抗-D免疫球蛋白產品中存在的抗體的多樣性一樣有效，或者是有可能多于一種免疫球蛋白同種型即IgG1和IgG3的存在{Siegel，Czerwinski等，2002 10320/id}增加了RBC清除率。除了效力的問題，有關HDN預防的另一問題是其中RhDVI(+)母體孕有RhD(+)嬰兒的情況。在這種情況下，抗-RhDVImAb將不能防止母體的異源免疫。因而，為了保護RhD(-)和RhDVI(+)母體，需要具有對抗恒河猴D VI型抗原的抗體以及具有不結合VI型抗原而是其它一般的恒河猴D抗原的抗體的產品。mAb的另一可能的問題是它們可能是免疫原性的。盡管mAb是人的，第一次治療可能在用該mAb治療的母體中導致抗體反應。理論上，因為該mAB的CDR區(該區之前從未被受治的個體的免疫系統見過)如果以足夠大的劑量存在可能會被識別為外源物質，這是可能發生的。這種反應使該抗-RhD mAb失效，除非重復進行預防性治療。通過混合單克隆抗體而克服使用mAb的一些潛在問題是可能的。然而，這將意味著單獨產生和純化未確定數量的抗體，這將是十分費錢的。而且，這種混合物的單獨單克隆抗體的不同批次的性質可能影響最終的產品。本申請公開內容本專利技術提供了用于產生生產型細胞系的方法，所述的細胞系可以單批次表達抗-RhD重組多克隆抗體(抗-RhD rpAb)。專利技術描述本專利技術提供了用于一致性地生產抗-RhD重組多克隆抗體(抗-RhDrpAb)的方法。期望本專利技術將開拓大規模生產和產生一類新的預防和治療性抗-RhD抗體產品的可能性。本專利技術的抗-RhD rpAb潛在地具有一些優于單克隆抗-恒河猴D抗體的優勢。首先，每種潛在的恒河猴D表位將由多于一種的抗體覆蓋，因而抗-RhD rpAb組合物可用于預防性治療孕有RhD(+)嬰兒的RhD(-)和RhDVI母體。因而，將不必混合來自不同生產和純化批次的mAb以便獲得完全本文檔來自技高網...

【技術保護點】
產生細胞集合的方法，所述細胞適于作為用于表達抗－ＲｈＤ重組多克隆抗體的生產型細胞系，所述的方法包括　　　　ａ）提供了抗－ＲｈＤ抗體表達載體文庫，其中所述文庫的每個單獨載體包括：１）單拷貝的編碼抗－ＲｈＤ多克隆抗體的獨特成員的核酸片段和２）一個或多個重組酶識別序列；　　　　ｂ）將所述的抗－ＲｈＤ抗體表達載體文庫導入宿主細胞系，其中所述宿主細胞系的各單個細胞的基因組包含重組酶識別序列，所述的識別序列在其基因組中與載體上的重組酶識別序列匹配；　　　　ｃ）確保在所述細胞中存在一個或多個重組酶，以使步驟（ａ）中的編碼抗－ＲｈＤ抗體的核酸片段位點特異性地整合進宿主細胞系的細胞中，其中所述的重組酶是ｉ）由導入了所述核酸序列的所述細胞表達的；ｉｉ）由步驟（ａ）中的載體有效編碼；ｉｉｉ）通過第二載體表達而提供；或ｉｖ）作為蛋白質提供給所述細胞；和　　　　ｄ）選擇細胞，所述的細胞含有來自所述抗－ＲｈＤ抗體表達載體文庫的整合的編碼抗－ＲｈＤ抗體的核酸片段的拷貝。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：SK拉斯姆森，AB托爾斯特魯普，SB弗雷德里克森，J豪拉姆，
申請(專利權)人：西福根有限公司，
類型：發明
國別省市：DK[丹麥]