靶定的免疫原制造技術

本發明專利技術提供了用于產生和利用靶定的免疫原的試劑和方法。在優選實施方案中，將免疫原綴合到將該免疫原靶向ＭＨＣ呈遞途徑的氨基酸序列。使用本文提供的試劑和方法，可以增強免疫方案，從而導致增加的宿主免疫性。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于改進免疫方案的試劑和方法。例如，將免疫原性氨基酸序列導向MHC呈遞途徑的氨基酸序列。
技術介紹
盡管基于肽的疫苗有許多優點(安全、易于生產)，但是它們顯示出有限的免疫原性。這部分是由于外源肽不能有效進入I類MHC呈遞途徑。從而，可以增強肽向MHC遞送的策略具有增加基于肽的疫苗的功效的潛力。一種策略是將免疫原性序列連接到“蛋白質轉導結構域”(PTD)，已經表明所述結構域驅動蛋白質和肽越過細胞膜的轉運。示例性PTD包括HIT-Tat、細胞穿透肽(CPP)、Trojan載體、觸角足同源域和人period-1蛋白。在一種方法中，抗原性肽附著到來自HIV-1 tat的短陽離子肽(即，殘基49-57)以形成融合綴合物。已經表明抗原呈遞細胞(“APC”)，如樹突細胞的暴露可加工ova-tat綴合物，從而導致抗原特異的CD8+T細胞的刺激(Kim，等人J Immunol 1997 Aug 15；159(4)1666-8；Shibagaki，等人J Immunol 2002 Mar 1；168(5)2393-401)。這也已經對人黑素瘤抗原TRP2得到了證明(Wang，等人J Clin Invest 2002 Jun；109(11)1463-70)。將tat肽綴合到全長蛋白質后證明了相反的證據(Leifert，等人Gene Ther2002 Nov；9(21)1422-8)。在另一方法中，將觸角足同源域(AntpHD)與CTL表位融合并且表明其增強了CD8+T細胞反應性(Chikh，等人J Immunol 2001Dec 1；167(11)6462-70；Pietersz，等人Vaccine 2001 Jan 8；19(11-12)1397-405；Schutze-Redelmeier，等人J Immunol 1996 Jul15；157(2)650-5)。已經表明可以使用具有最多達50個氨基酸的抗原性序列的AntpHD。在其他研究中，已經表明來自人period-1蛋白質的轉導序列(hPER1，序列SRRHHCRSKAKRSRHH)有效越過細胞膜。因此，它是吸引人的抗原遞送載體候選物。如下面詳細描述的，hPER1實際上增強抗原呈遞和T細胞反應性。附圖簡述附圖說明圖1.通過hPER1綴合物體外敏化靶細胞進行肽特異裂解。圖2.用hPER1綴合物肽體外誘導人T細胞應答。圖3.用hPER1綴合物肽不用佐劑體內誘導T細胞應答。圖4.靜脈內(i.v.)注射肽脈沖的DC后C57BL/6小鼠中的CTL應答。用經所指示的肽脈沖的5×105個骨髓來源的DC靜脈內免疫小鼠。免疫后一周從接種的動物收獲脾細胞，用SIINFEKL肽再刺激5天，并在標準鉻釋放測定中用SIINFEKL肽脈沖的靶細胞測試CTL活性。圖5.皮下(s.c.)注射肽后HLA-A2/Kb轉基因小鼠中的CTL應答。將小鼠用50μg所指示的肽皮下免疫并在第一次注射后第21和42天加強免疫。在免疫后63天收獲來自免疫動物的脾細胞，用天然gp100-154肽再刺激5天，并在標準鉻釋放測定中用gp100-154肽脈沖的靶細胞測試CTL活性。圖6.轉基因A2/Kb小鼠中hPER1-FVYVW-154介導CTL應答可以通過不同的免疫途徑產生。所示結果代表每組的四只個別小鼠的平均值。圖7.用綴合SIINFEKL表位的hPER1或者Tat肽體內誘導T細胞應答。用通過DEVWEL接頭序列結合于Tat或者hPER1的SIINFEKL肽皮下免疫小鼠。該圖中所示結果代表每組的四只個別小鼠的平均值。與IFA中的陽性對照SIINFEKL相比，hPER1-DEVWEL-SIINFEKL得到最佳的CTL應答。圖8.輔助CD4乙型肝炎肽的存在對于產生針對CD8肽的CTL應答是必需的。用從50納摩爾到1納摩爾的不同劑量的hPER1-FVYVW-154肽用或者不用輔助肽鼻內接種A2/Kb小鼠。不存在輔助肽時，10納摩爾hPER1-FVYVW-154不誘導顯著細胞毒性。圖9.不存在輔助肽時，用較高的肽劑量免疫可以在小鼠中誘導T細胞應答。用不同劑量的hPER1-SGQL-SIINFEKL用或者不用輔助肽皮內免疫C57BL/6小鼠。圖10.在不同接頭序列存在下，用結合SIINFEKL的hPER1進行無佐劑的肽免疫后體內誘導免疫性。結果顯示了每組的4只個別小鼠的平均值。FVYVW接頭已經產生了最顯著的CTL殺傷，其與存在不完全弗氏佐劑(IFA)時的SIINFEKL免疫相當。圖11.OVA(SIINFEKL)肽呈遞的體外分析。將來自C57BL/6小鼠的脾細胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脈沖1小時，洗滌，并溫育0、4、8、24或30小時。使用轉導肽脈沖的細胞與bGAL肽預溫育以阻斷任何細胞表面結合。然后通過ELISPOT測試細胞誘導從SIINFEKL特異T細胞分泌IFN-γ的能力。大于300/孔的點數不能計數。*＝未測試的樣品。圖12.NP肽呈遞的體外分析。將來自C57BL/6小鼠的脾細胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脈沖1小時，洗滌，并溫育0、24、72或120小時。通過ELISPOT測試細胞誘導從NP-特異T細胞分泌IFN-γ的能力。圖13.hPER1-FVYVW-gp100-154肽免疫后長期免疫性的誘導。僅用gp100-154肽或者結合hPER1-FVYVW皮下免疫3周或者3個月后A2/Kb小鼠中的CTL應答。結果顯示了單個小鼠(4只小鼠/組)。hPEr1-FVYVW-154免疫后分別在4/4或者3/4小鼠中觀察到短期(3周)以及長期(3個月)T細胞應答。相比而言，僅用154免疫不產生顯著CTL應答。專利技術概述本專利技術提供了用于產生和利用靶定的免疫原的試劑和方法。在優選實施方案中，將免疫原綴合到氨基酸序列，所述序列將免疫原靶向MHC用于呈遞。使用本文提供的試劑和方法，可以增強免疫方案，從而導致宿主的增強的免疫性。詳述本專利技術提供了用優選將肽導向MHC呈遞途徑的氨基酸序列(本文中稱作“靶向序列”)將免疫原靶向MHC途徑的方法。該靶向策略可以用于例如基于肽的免疫方案中，以用于在樹突細胞中表達抗原，用于核酸疫苗，和基于載體(即，病毒、細菌)的接種。為了描述本專利技術，將連接到靶向氨基酸序列的免疫原性氨基酸序列稱作“靶定的免疫原”。術語“靶定的免疫原”包括其片段、變體或者衍生物。靶向序列可以包括，例如，本領域已知的任意轉導序列。優選來自觸角足、TAT、VP22或hPER1蛋白的序列(即，靶向序列)。更優選的靶向序列包括例如TATGYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)AntPRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO.2)PER1-1SRRHHCRSKAKRSRHH(SEQ ID NO.3)PER1-2RRHHRRSKAKRSR(SEQ ID NO.4)在一個實施方案中，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位結合到hPER1轉導序列以形成靶定的免疫原(或者“hPER1-CTL綴合物”)。優選對宿主施用靶定的免疫原導致抗免疫原免疫應答，其大于僅用該免疫原得到的免疫應答(即，增加的細胞毒性T細胞應答)。適宜的免疫原還可以包括例如，腫瘤抗原(TA)的肽序列。術語“TA”包括腫瘤相關抗原本文檔來自技高網...

【技術保護點】
多肽，其基本上由連接到包含細胞毒性Ｔ淋巴細胞表位的第二個氨基酸序列的包含ｈＰＥＲ１的轉導序列的第一個氨基酸序列組成，其中所述轉導序列是ＲＲＨＨＲＲＳＫＡＫＲＳＲ。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：AR昂格爾，D薩爾哈，S加利錢，
申請(專利權)人：圣諾菲帕斯圖爾公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]