RBBP4靶向多肽和抗腫瘤多肽及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種RBBP4靶向多肽和一種抗腫瘤多肽及其應用。所述RBBP4靶向多肽氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。所述抗腫瘤多肽包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域，所述RBBP4靶向結構域的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。本發明專利技術的抗腫瘤多肽的穿膜結構域本身沒有細胞毒性，但連接RBBP4靶向結構域后，有明顯的抑制腫瘤增殖、遷移侵襲的效應。本發明專利技術的抗腫瘤多肽，不僅可以單獨作為抗腫瘤的生物治療藥物，還有望結合其他治療方式來抑制腫瘤。

【技術實現步驟摘要】
RBBP4靶向多肽和抗腫瘤多肽及其應用
本專利技術涉及腫瘤靶向治療領域，更特別地，涉及一種RBBP4靶向多肽和一種抗腫瘤多肽及其應用。
技術介紹
惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，是世界范圍內一個主要的致死因素。常規的腫瘤治療手段包括化療、放療、手術切除等。但這些方法通常會對機體的正常組織帶來損傷，造成很大的毒副作用，給腫瘤患者帶來極大的痛苦。因此，特異性高、療效顯著的腫瘤靶向治療方法引起了人們的極大興趣。腫瘤靶向療法指通過干擾參與腫瘤細胞發生、發展和擴散相關的特殊分子，進而抑制腫瘤進展的治療方法。腫瘤靶向療法區別于傳統化療，有其特定的靶標分子，人們也正在努力開發各種腫瘤靶向療法。目前認為，靶向性多肽是比較理想的腫瘤靶向治療手段，具有以下優勢：1)血漿清除速度快，親和力高，特異性強；2)良好的組織穿透性，能被腫瘤細胞攝取；3)易于化學合成，且免疫原性低，可避免單克隆抗體治療的不足。因此，近年來許多學者應用肽庫技術尋找可能與腫瘤細胞特異結合的短肽，以達到靶向治療腫瘤的目的。多梳抑制復合物2(PRC2)是一類重要的表觀遺傳抑制復合物，能通過調控組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化(H3K27)，抑制基因的轉錄。PRC2在腫瘤的發生、發展中具有重要作用。相對于正常細胞，腫瘤細胞中PRC2復合物對抑癌基因的抑制活性顯著增強。PRC2在腫瘤中的關鍵作用使得它成為腫瘤表觀遺傳療法的重要靶標。PRC2與多種腫瘤，如結腸癌、乳腺癌、白血病、肝癌、口腔癌的相關性已引起人們日益增多的關注。人類PRC2復合物由四個核心組分組成，即，胚胎外胚層發育蛋白(EED)、果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)、Zeste人12同源物1抑制因子2(SUZ12)和RBBP4。其中，EZH2是核心催化亞基，RBBP4與SUZ12負責結合核小體，EED能增強EZH2的催化作用。已有多項研究針對EZH2設計多肽及藥物，抑制其功能，達到治療腫瘤的作用，然而尚缺乏針對RBBP4蛋白設計的多肽或藥物研究。RBBP4蛋白是WD40家族中的一員，定位于細胞核內，能直接結合組蛋白H3-H4復合物，也參與多種組蛋白結合復合物的形成；除PRC2復合物以外，RBBP4參與組蛋白去乙酰化酶(HDAC)復合物、核小體重塑脫乙酰基酶(NuRD)復合物的形成，調節染色質結構及功能。對RBBP4進行靶向結合，能削弱PRC2復合物的形成，并抑制其催化活性，從而達到治療腫瘤的效果。細胞穿膜肽(CPP)是一類具有很強穿透細胞膜能力的短肽，具有正電荷，既可以從生物體內提取，也可以通過人工合成。該多肽可以直接穿透細胞膜，進入細胞漿和細胞核，有利于進一步作為載體攜帶藥物進行抗腫瘤治療。同時，對正常組織毒副作用小，從根本上改善基因治療的安全與倫理問題。對進一步研制高效、安全的靶向治療藥物具有重要意義，可望推動惡性腫瘤分子靶向治療的發展與進程。因此，需要構建一種既能靶向腫瘤細胞，又能高效入胞的新型多肽。
技術實現思路
為解決以上問題，專利技術人制備了一種靶向RBBP4的多肽，并將該多肽與細胞穿膜肽通過共價鍵連接起來，達到既有靶向腫瘤細胞，又具有高效入胞的效果。基于該研究，本專利技術提供了一種RBBP4靶向多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本專利技術還提供了上述RBBP4靶向多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。本專利技術還提供了一種抗腫瘤多肽，其包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域，所述RBBP4靶向結構域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。優選地，所述穿膜結構域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。優選地，所述RBBP4靶向結構域位于所述抗腫瘤多肽的C端，并且所述穿膜結構域位于N端。本專利技術還提供了上述抗腫瘤多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。本專利技術的優點在于，本專利技術的抗腫瘤多肽的穿膜結構域本身沒有細胞毒性，但連接RBBP4靶向結構域后，有明顯的抑制腫瘤增殖、遷移侵襲的效應。本專利技術的抗腫瘤多肽，不僅可以單獨作為抗腫瘤的生物治療藥物，還有望結合其他治療方式來抑制腫瘤。附圖說明圖1為用RBP-25和對照多肽孵育腫瘤細胞后的熒光顯微鏡照片；圖2為不同濃度的RBP-25對SW480增殖活性影響的統計圖；圖3為不同濃度的RBP-25對SK-N-SH增殖活性影響的統計圖；圖4為RBP-25處理不同時間對SW480增殖活性影響的統計圖；圖5為RBP-25處理不同時間對SK-N-SH增殖活性影響的統計圖；圖6為Transwell實驗的結晶紫染色照片；圖7為根據圖6計數得到的IMR32細胞的Transwell實驗的細胞計數圖；圖8為根據圖6計數得到的SK-N-SH細胞的Transwell實驗的細胞計數圖；圖9為倒置顯微鏡下動態觀察HUVEC小管形成的照片；圖10為RBBP4抗體免疫沉淀EZH2/SUZ12的westernblot檢測照片；圖11為RBP-25處理后SK-N-SH細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的westernblot檢測照片；圖12為RBP-25處理后MCF-7細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的westernblot檢測照片；圖13為RBP-25處理后SK-N-SH細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相對轉錄水平；圖14為RBP-25處理后MCF-7細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相對轉錄水平。具體實施方式以下結合實例對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本專利技術，并非用于限定本專利技術的范圍。1.RBBP4靶向多肽的鑒定以及抗腫瘤多肽的合成通過生物信息學和蛋白定點突變技術，獲取針對RBBP4的多肽氨基酸序列SEQIDNO:2。通過固相合成法合成一種抗腫瘤多肽，其包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域(SEQIDNO:1)，為了研究方便，我們還在RBBP4靶向結構域的C端標記的異硫氰酸熒光素標記，氨基酸序列為YGRKKRRQRRR-MEILQSDYILAQVK-FITC(命名為RBP-25)，由武漢百意欣生物技術有限公司合成。合成步驟如下：1)稱取n當量樹脂放入反應器，加入二氯甲烷(DCM)溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入序列中第一個氨基酸2n當量，加2n當量的二異丙基乙胺(DIEA)，適量的二甲基甲酰胺(DMF)、DCM(適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)、DIEA、DMF、DCM，氮氣鼓泡反應60分鐘。然后加入約5n當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用DMF、甲醇洗凈。2)往反應器中加入序列中第二個氨基酸(也為2n當量)，2n當量1-羥基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸鹽(HBTU和DIEA，氮氣鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗凈，加入適量的脫帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護基，洗凈，茚三酮檢測。3)依步驟2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸并進行各種修飾。4)將樹脂用氮氣吹干后從反應柱中取下，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量(切割液和樹脂大約以10ml/克的比例)的切割液(組成是95％三氟乙酸、2％乙二硫醇、2％三異丙基硅烷、1％水)，震蕩，濾掉樹脂。5)得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗即可得到序列的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種RBBP4靶向多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

【技術特征摘要】
1.一種RBBP4靶向多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.權利要求1所述的RBBP4靶向多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。3.一種抗腫瘤多肽，其特征在于，包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域，所述RBBP4靶向結構域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.根據權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：童強松，鄭麗端，李聃，宋華杰，葉霖，方二虎，楊楓，王曉靜，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，
類型：發明
國別省市：湖北,42