一種人源抗VEGFR2抗體及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種人源抗VEGFR2抗體及其應用。本發明專利技術提供的人源抗VEGFR2抗體，為一種IgG，其重鏈由重鏈可變區和重鏈恒定區組成，其輕鏈由輕鏈可變區和輕鏈恒定區組成；所述重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基；所述輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基。本發明專利技術對于人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移引起的疾病以及腫瘤的治療具有重大的應用價值。

【技術實現步驟摘要】
一種人源抗VEGFR2抗體及其應用
本專利技術涉及一種人源抗VEGFR2抗體及其應用。
技術介紹
腫瘤血管為腫瘤發生、發展提供足夠的氧分和營養，靶向腫瘤血管新生可以達到餓死腫瘤的治療效果，但是腫瘤血管新生的分子調控機制非常復雜，需要許多生長因子、受體及信號通路的介導。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是血管新生的必要細胞因子，而VEGFR2是VEGF的三個受體之一，主要負責血管新生的信號通路轉導。針對VEGF的抑制劑貝伐單抗(Bevacizumab)是由基因泰克公司開發的一種針對VEGF的重組人源化單克隆抗體，由93％人源和7％的鼠源部分組成。2004年2月26日獲得FDA的批準在美國上市是美國第一個獲得批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥物。貝伐單抗2004年全球銷售額為5.56億美元，2013達到為70.37億美元。針對VEGFR2的抑制劑雷莫盧單抗(ramucirumab)，是禮來公司收購ImClone公司的IMC-1121B項目后，開發并成功上市。雷莫盧單抗是針對VEGFR2的全人IgG1單克隆抗體，特異性結合KDR/VEGFR2。該藥物于2014年5月在美國上市，應用于晚期或轉移性胃癌或胃食管結合部腺癌。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種人源抗VEGFR2抗體及其應用。本專利技術提供的人源抗VEGFR2抗體，為一種IgG，其重鏈由重鏈可變區和重鏈恒定區組成，其輕鏈由輕鏈可變區和輕鏈恒定區組成；所述重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基；所述輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基。所述重鏈具體可為序列表的序列1所示的多肽。所述輕鏈具體可為序列表的序列3所示的多肽。編碼所述IgG的基因也屬于本專利技術的保護范圍。編碼所述重鏈的基因為如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2自5’末端第10-1398位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；編碼所述輕鏈的基因為如下(3)或(4)：(3)序列表的序列4自5’末端第25-726位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4所示的DNA分子。本專利技術還保護所述IgG在制備抑制血管細胞生長和/或增殖和/或遷移和/或微管形成的產品中的應用。所述血管細胞為人臍靜脈內皮細胞。所述人臍靜脈內皮細胞具體為HUVEC細胞。本專利技術還保護所述IgG在制備抑制脈絡膜新生血管形成的產品中的應用。本專利技術還保護所述IgG在制備抑制腫瘤細胞生長和/或增殖的產品中的應用。所述腫瘤細胞為人肝癌細胞。所述人肝癌細胞具體為HepG-2細胞。本專利技術還保護所述IgG在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用。所述腫瘤生長體現為腫瘤的體積變大和/或腫瘤的質量增加。所述腫瘤具體可為肝癌。所述腫瘤具體可為人肝癌細胞引起的腫瘤或皮下移植瘤。所述人肝癌細胞具體為HepG-2細胞。本專利技術提供了對VEGFR2的全人單克隆抗體，能夠阻斷VEGFR2與其配體VEGF結合，抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移。本專利技術對于人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移引起的疾病以及腫瘤的治療具有重大的應用價值。附圖說明圖1為重組質粒pCMV-H+L的結構示意圖。圖2為FORTBIO試驗結果。圖3為抗體能有效抑制VEGF誘導的HUVEC細胞增殖的試驗結果。圖4為抗體能有效抑制HUVEC細胞增殖的試驗結果。圖5為抗體有效抑制HUVEC細胞遷移的試驗結果。圖6為抗體有效抑制HUVEC細胞微管形成的試驗結果。圖7為分組處理過程中受試動物的體重變化。圖8為分組處理結束后，受試動物的瘤重分布圖(每個點單表一個受試動物)。圖9為分組處理結束后，受試動物的腫瘤體積。圖10為分組處理結束后，受試動物的瘤體積抑制率。圖11為熒光面積改善率結果。圖12為眼底視網膜增厚改善率結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)：ATCC編號為CRL-9096。HUVEC細胞(人臍靜脈內皮細胞)：sciencell公司，產品目錄號為8000。HepG-2細胞(人肝癌細胞株)：ATCC編號為A019。實施例1、VEGFR2特異抗體的發現一、人源單克隆抗體文庫建立從30名知情同意的志愿者獲得外周血，分離淋巴細胞并提取總RNA。將總RNA反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，用兼并引物PCR擴增抗體重鏈和輕鏈的可變區(VH和VL)。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收VH的DNA和VL的DNA，用重疊PCR連接成單鏈抗體(scFv)基因。將來自不同的志愿者的單鏈抗體基因等量混合，分組用內切酶切割，然后進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段并連接到已經用相同內切酶切割的噬菌粒載體質粒，將連接后的噬菌粒載體質粒用電鉆孔轉染大腸桿菌，獲得噬菌體單鏈抗體庫。二、VEGFR2人源單克隆抗體篩選首先將重組人VEGFR2蛋白質包被在10厘米板上，加入單鏈抗體噬菌體并孵育，洗去未結合的噬菌體，回收結合的噬菌體并感染大腸桿菌，以便擴增噬菌體。將第一輪獲得并擴增的噬菌體再加入到包被有VEGFR2蛋白質的10厘米板，進行第二輪篩選，如此重復，共進行三輪篩選富集。通過ELISA檢測富集的噬菌體對VEGFR2蛋白質的親和力。在三輪篩選的基礎上，通過PCR擴增陽性噬菌體內的抗體序列，獲得若干抗VEGFR2蛋白質的單鏈抗體。將各個單鏈抗體的VH的DNA和VL的DNA分別克隆到人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區氨基端，然后連接到哺乳動物表達載體，轉染CHO細胞，獲得若干抗VEGFR2全長抗體。通過ELISA比較各抗體對VEGFR2蛋白質的結合能力，其中一個抗體表現出對VEGFR2蛋白質的高度親和力，將該抗體命名為VEGFR2特異抗體。VEGFR2特異抗體的重鏈如序列表的序列1所示，重鏈可變區含有三個CDR區域(CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基)。VEGFR2特異抗體的重鏈的編碼序列如序列表的序列2所示。VEGFR2特異抗體的輕鏈如序列表的序列3所示，輕鏈可變區含有三個CDR區域(CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基)。VEGFR2特異抗體的輕鏈的編碼序列如序列表的序列4所示。實施例2、重組細胞的獲得一、重組質粒的構建1、合成編碼VEGFR2特異抗體的重鏈的DNA分子(序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子)并將其作為模板，采用H-F和H-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。H-F：GGCAAAGAATTCGCCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG；H-R：GAGCTCGAATTCCTATTTACCCGGAGACAGGGAG。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種IgG，其重鏈由重鏈可變區和重鏈恒定區組成，其輕鏈由輕鏈可變區和輕鏈恒定區組成；所述重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45?54位氨基酸殘基、第69?85位氨基酸殘基和第118?124位氨基酸殘基；所述輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44?54位氨基酸殘基、第70?76位氨基酸殘基和第109?117位氨基酸殘基。

【技術特征摘要】
1.一種IgG，其重鏈由重鏈可變區和重鏈恒定區組成，其輕鏈由輕鏈可變區和輕鏈恒定區組成；所述重鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸殘基、第69-85位氨基酸殘基和第118-124位氨基酸殘基；所述輕鏈可變區中的CDR1、CDR2和CDR3依次為序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸殘基、第70-76位氨基酸殘基和第109-117位氨基酸殘基。2.如權利要求1所述的IgG，其特征在于：所述重鏈為序列表的序列1所示的多肽；所述輕鏈為序列表的序列3所示的多肽。3.編碼權利要求2所述IgG的基因，其特征在于：編碼所述重鏈的基因為如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2自5’末端第10-1398位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊春，原野，洪海燕，李小雯，葉宇，
申請(專利權)人：北京步長新藥研發有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11