本發明專利技術公開了一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體，所述的Ppmar1轉座酶S171A突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。編碼所述Ppmar1轉座酶S171A突變體的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。是將野生型Ppmar1轉座酶171位置上的絲氨酸突變為丙氨酸。該Ppmar1轉座酶S171A突變體催化轉座子轉座的活性是野生型轉座酶的活性的10倍，為利用MLE轉座子開發基因標簽奠定了基礎，為后基因組時代大規模分離和標記基因，研究基因的功能提供了新工具。
【技術實現步驟摘要】
一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體及其應用
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體及其應用。
技術介紹
轉座子(transposon)是指在基因組上能從一個位點轉移到另一個位點的一段DNA序列。自20世紀40年代美國遺傳學家McClintock首先在玉米中發現轉座子(Ac/Ds)以來，科學家們發現了多種類型的轉座子，它們廣泛存在于細菌、酵母和高等動植物中。隨著人們在分子水平上對轉座子結構和功能認識的不斷深化，一些轉座子已被改造為基因標簽應用于基因分析，并逐漸成為大規模分離基因的重要手段之一。Mariner-Like轉座子(Mariner-LikeElements，MLE)是轉座子中一個重要家族，最早是在研究毛里塔尼亞果蠅(Drosophilamauristiana)白眼基因的一個不穩定突變時發現的。此后在其他動物以及植物基因組中也發現了大量MLE轉座子的存在。與其它轉座子相比較，MLE轉座子具有結構簡單、異源轉座率高、在基因組插入位點接近隨機等特點，在開發基因標簽，分離基因，研究基因功能上，遠遠優于其他轉座子。MLE轉座子由兩端反向重復序列(TerminalInvertedRepeats，TIRs)和編碼轉座酶的基因組成，轉座酶負責催化轉座子轉座，因此轉座酶的活性是影響轉座子的轉座頻率的主要因素。然而自然界分離的MLE轉座酶由于在進化過程中“垂直失活”效應積累了或多或少的突變，部分或全部喪失了催化轉座能力，成為低活性或非活性的轉座酶，嚴重影響了MLE轉座子的應用，因此人工構建高活性的轉座酶就顯得十分重要。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體及其應用，解決了現有自然界分離的MLE轉座酶催化活性較低或者不具備催化活性的問題。本專利技術提供了一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體，所述的Ppmar1轉座酶S171A突變體的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本專利技術還提供了一種編碼所述Ppmar1轉座酶S171A突變體的基因，編碼所述Ppmar1轉座酶S171A突變體的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本專利技術還提供了一種重組質粒，所述重組質粒攜帶有編碼所述Ppmar1轉座酶S171A突變體的基因。本專利技術還提供了一種工程菌株，所述工程菌株攜帶有上述重組質粒。本專利技術還提供了一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體在構建酵母突變體中的應用。與現有技術相比，本專利技術提供的一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體，具有以下有益效果：本專利技術從毛竹中克隆到的活性轉座酶，對其進行人工改造之后獲得較高活性的MLE轉座酶突變體(Ppmar1轉座酶S171A突變體)，Ppmar1轉座酶S171A突變體催化轉座子轉座的活性是野生型轉座酶的活性的10倍，為利用MLE轉座子開發基因標簽奠定了基礎，為后基因組時代大規模分離和標記基因，研究基因的功能提供了新工具。具體實施方式下面結合具體實施方式對本專利技術進行詳細說明，但應當理解本專利技術的保護范圍并不受具體實施方式的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，如Sambrook等主編的《分子克隆實驗指南》中所述條件，或按照試劑盒陳述的步驟進行操作，由于不涉及專利技術點，故不對其步驟進行詳細描述。當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本專利技術另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本專利技術中使用的所有技術和科學術語與本
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本
的技術人員對現有技術的掌握及本專利技術的記載，還可以使用與本專利技術實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本專利技術。一、野生型MLE轉座酶和去除轉座酶的非自主性轉座子的獲得步驟1.1，采集新鮮的毛竹葉片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江農林大學植物園，北緯N30°15′14.67″東經E119°43′33.47″)，利用CTAB法提取毛竹基因組DNA，根據MLE轉座子TIR保守序列設計引物Ppmar1-5-3(Ppmar1-5-3的序列信息見表1)，進行PCR擴增，得到MLE轉座子擴增產物。PCR擴增的體系為20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，1μlPpmar1-5-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，100ng毛竹基因組DNA，加無菌水補齊20μl。PCR擴增的反應條件為：預變性94℃5min；變性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35個循環；72℃2min，4℃10min。步驟1.2，擴增出序列后，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit試劑盒的方法將步驟1.1的MLE轉座子擴增產物連接到pMD18-T載體，測序確認后，命名為Ppmar1轉座子，Ppmar1轉座子全長序列如SEQIDNO.3所示。步驟1.3，采用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit試劑盒提取毛竹葉片RNA，通過Invitrogen公司的SuperScriptTMVILOTMcDNASynthesisKit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，根據Ppmar1轉座酶序列設計一對引物PpTpase1-5和PpTpase1-3(PpTpase1-5和PpTpase1-3的序列信息見表1)，進行PCR擴增，回收得到Ppmar1轉座酶擴增產物，即為Ppmar1轉座酶核苷酸序列。PCR擴增的體系為20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，0.5μlPpTpase1-5(10μmol/L)，0.5μlPpTpase1-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，10ng毛竹葉片cDNA，加無菌水補齊20μl。PCR擴增的反應條件為：預變性94℃5min；變性94℃30s，55℃30s，延伸72℃40s，35個循環；72℃2min，4℃10min。步驟1.4，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit試劑盒的方法將步驟1.3的Ppmar1轉座酶核苷酸序列連接到pMD18-T載體克隆，測序確認，Ppmar1轉座酶核苷酸序列和相應的氨基酸序列分別如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。將含有Ppmar1轉座子全長序列的pMD18-T載體用BseRI切除Ppmar1中間轉座酶的大部分序列。酶切體系為50μl，包括5μl10×buffer，1μlBseRI(1U/μl)，1μg質粒(含有Ppmar1全長序列的pMD18-T載體)，加無菌水補齊50μl，37℃溫浴6小時。回收質粒大片段，用T4DNALigase將質粒大片段自連接，得到Ppmar1的非自主性轉座子pMD18-T-Ppmar1-Tn(Tn表示非自主性轉座子)。其中，自連接的體系為10μl，包括1μl10×本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體，其特征在于，所述的轉座酶S171A突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種具有高催化活性的Ppmar1轉座酶S171A突變體，其特征在于，所述的轉座酶S171A突變體的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一種編碼所述Ppmar1轉座酶S171A突變體的基因，其特征在于，編碼所述轉座酶S171A突變體的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周明兵，湯定欽，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。