一種培育水稻普通核不育系的方法技術

本發明專利技術公開了一種培育水稻普通核不育系的方法，包括以下步驟：利用CRISPR/Cas9系統，根據水稻普通核不育基因設計靶位點序列；構建含靶位點序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體；將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入保持系的胚性愈傷組織中得到轉基因苗；篩選轉基因苗中的轉基因陽性植株；篩選轉基因陽性植株中的突變植株；將突變植株進行繁種，于后代植株中分離不含轉基因成分的普通核不育系。本發明專利技術通過編輯普通核不育基因，實現快速培育普通核不育系的目標，育種周期短、成本低且實用性強。

【技術實現步驟摘要】
一種培育水稻普通核不育系的方法
本專利技術涉及水稻生物技術育種領域，具體涉及一種培育水稻普通核不育系的方法。
技術介紹
普通核不育受一對隱性核基因控制，一般不受外部環境因子的影響，不管環境條件怎樣變化，總是表現為不育。在生產應用中，普通核不育具有以下優點：1)育性正常的品種都是它的恢復系，恢復譜及其廣泛，配組自由使得選育優良組合的幾率大增；2)能緊跟常規稻的選育步伐，開辟秈粳亞種間雜種優勢新領域，使水稻產量在現有雜交水稻基礎上實現更高產目標。因此，袁隆平院士將普通核不育系應用于雜交水稻制種的技術稱為第三代的雜交水稻。目前普通核不育系的繁殖難題已經攻克，湖南雜交水稻研究中心申請的ZL201210426678.7號和ZL201210426939.5號中國專利文獻中記載了利用基因工程手段構建工程保持系來大規模繁殖普通核不育系的方法，為普通核不育系應用于實際生產奠定了基礎。但利用普通核不育系配制高產、高抗和質優的超級稻組合還存在難題，主要的難題就是優良普通核不育系的選育方面還只能通過傳統的物理化學方法誘變優良的保持系和恢復系等可育材料獲得或者將這些優良的可育材料與不育系通過多代回交選育獲得。物理化學誘變方法具有隨機性，效率低下，勞動強度大；回交選育需要經過多代回交進行背景篩選，時間跨度大，即使經過多代回交也很難恢復原有的遺傳背景，導致原有的一些優良性狀丟失和利用工程保持系所繁育的普通核不育系株型不一致。所以，這兩種傳統方法都有很大的局限性，延緩了第三代雜交水稻技術在生產制種中的應用。要突破傳統方法的局限，必須利用基因工程手段。近年來，基因組編輯技術取得了突破性進展，尤其是以TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和CRISPR/Cas9(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPRassociated)這兩種高效的基因編輯技術的成熟和完善，已廣泛應用于各種生物的基因組的定點突變。比如CN201410496037.8號和CN201510009526.0號專利報道了利用CRISPR/Cas9基因編輯系統定點突變控制水稻光溫敏不育性狀的tms5基因和P-TMS12-1基因實現快速培育兩系不育系目標的方法。目前尚沒有采用CRISPR/Cas9基因工程手段快速培育普通核不育系的方法。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種利用基因組編輯技術定點突變普通核不育基因獲得普通核不育系的方法，通過徹底失活普通核不育基因，實現快速培育普通核不育系的目標，育種周期短、成本低且實用性強，將為推進第三代雜交水稻的廣泛應用具有重要意義。為此，本專利技術提供了一種培育水稻普通核不育系的方法，包括以下步驟：S1、利用CRISPR/Cas9系統，根據水稻普通核不育基因設計靶位點序列；S2、構建含所述靶位點序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體；S3、將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入保持系的胚性愈傷組織中得到轉基因苗；S4、篩選所述轉基因苗中的轉基因陽性植株；S5、篩選所述轉基因陽性植株中的突變植株；S6、將所述突變植株進行繁種，于后代植株中分離不含轉基因成分的普通核不育系。上述的方法，優選的，所述步驟S1中設計的靶位點序列的一條鏈具有以下結構中的一種：5’-(N)n-NGG-3’、5’-(N)n-NAG-3’、5’-(N)n-NGA-3’，所述N表示A，T，C和G中的任意一個，14≤n≤30。上述的方法，優選的，所述普通核不育基因為msp1、pair1、pair2、zep1、mel1、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、rip1、csa和aid1中的一種。上述的方法，優選的，所述普通核不育基因為ptc1，所述靶位點序列包括PTC1-Target1和PTC1-Target2，所述PTC1-Target1的DNA序列為SEQIDNO.1所示的序列，所述PTC1-Target1的DNA序列為SEQIDNO.2所示的序列。上述的方法，優選的，所述步驟S2具體包括以下步驟：S2-1、根據靶位點序列以及酶切位點信息，設計帶粘性末端的接頭引物；S2-2、酶切原始載體；S2-3、將所述帶粘性末端的接頭引物退火后連接到酶切過的原始載體上，得到重組的gRNA表達盒；S2-4、將所述重組gRNA表達盒進行PCR擴增得到擴增產物；S2-5、酶切擴增產物，將酶切后的擴增產物連接到酶切過的pCRISPR/Cas9載體上得到重組載體。上述的方法，優選的，所述步驟S2-1中所述接頭引物包括PTC1-Target1-F、PTC1-Target1-R、PTC1-Target2-F和PTC1-Target2-R；所述PTC1-Target1-F的DNA序列為SEQIDNO.3所示的序列，所述PTC1-Target1-R的DNA序列為SEQIDNO.4所示的序列，所述PTC1-Target2-F的DNA序列為SEQIDNO.5所示的序列；所述PTC1-Target2-R的DNA序列為SEQIDNO.6所示的序列。上述的方法，優選的，所述原始載體為pU3-gRNA或pU6a-gRNA。上述的方法，優選的，所述步驟S2-2中采用BsaI酶切所述原始載體；所述步驟S2-3中，所述帶粘性末端的接頭引物位于所述表達載體的兩個BsaI酶切位點之間，形成重組的gRNA表達盒；所述步驟S2-5中，采用BsaI酶切所述擴增產物。上述的方法，優選的，所述步驟S5步驟具體為：提取所述轉基因陽性植株的DNA，進行PCR擴增得到擴增產物；對所述擴增產物進行測序，選擇任一靶位點發生功能缺失突變的T0代純合突變體作為突變植株。上述的方法，優選的，所述步驟S6具體為：將突變植株與保持系回交，于后代植株中分離不含轉基因成分的普通核不育系。與現有技術相比，本專利技術的優點在于：(1)本專利技術提供了一種基于CRISPR/Cas9系統靶向突變普通核不育基因獲得普通核不育系的方法，培育出的普通核不育系不含轉基因成分，與物理化學誘變方法和回交選育方法獲得的普通核不育系沒有本質區別，規避了轉基因帶來的潛在風險。(2)本專利技術提供了一種水稻普通核不育系的方法，實現了快速培育普通核不育系，比物理化學誘變方法效率高，基因組損傷小；比傳統的回交選育方法節省時間(傳統的回交選育方法一般需要4～6年，而本專利技術提供的水稻普通核不育系的方法僅需兩年)，并且能克服傳統的回交選育導致原有的一些優良性狀丟失和利用工程保持系所繁育的普通核不育系株型不一致的缺點。附圖說明為使本專利技術實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。圖1為本專利技術培育普通核不育系的流程圖。圖2為五個陽性植株的突變類型，其中WT為野生型832B；PTC-M1至PTC-M5為5個陽性植株。圖3為PT6-F/PT6-R引物對BC1F2群體中的單株進行PTC1基因分型的部分結果。圖4為雜合單株與普通核不育系單株穎花形態對比。其中雜合單株花藥為淺黃色，內含正本文檔來自技高網...

【技術保護點】
培育水稻普通核不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1、利用CRISPR/Cas9系統，根據水稻普通核不育基因設計靶位點序列；S2、構建含所述靶位點序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體；S3、將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入保持系的胚性愈傷組織中得到轉基因苗；S4、篩選所述轉基因苗中的轉基因陽性植株；S5、篩選所述轉基因陽性植株中的突變植株；S6、將所述突變植株進行繁種，于后代植株中分離不含轉基因成分的普通核不育系。

【技術特征摘要】
1.培育水稻普通核不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1、利用CRISPR/Cas9系統，根據水稻普通核不育基因設計靶位點序列；S2、構建含所述靶位點序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體；S3、將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入保持系的胚性愈傷組織中得到轉基因苗；S4、篩選所述轉基因苗中的轉基因陽性植株；S5、篩選所述轉基因陽性植株中的突變植株；S6、將所述突變植株進行繁種，于后代植株中分離不含轉基因成分的普通核不育系。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中設計的靶位點序列的一條鏈具有以下結構中的一種：5’-(N)n-NGG-3’、5’-(N)n-NAG-3’、5’-(N)n-NGA-3’，所述N表示A，T，C和G中的任意一個，14≤n≤30。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述普通核不育基因為msp1、pair1、pair2、zep1、mel1、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、rip1、csa和aid1中的一種。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述普通核不育基因為ptc1，所述靶位點序列包括PTC1-Target1和PTC1-Target2，所述PTC1-Target1的DNA序列為SEQIDNO.1所示的序列，所述PTC1-Target1的DNA序列為SEQIDNO.2所示的序列。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟S2具體包括以下步驟：S2-1、根據靶位點序列以及酶切位點信息，設計帶粘性末端的接頭引物；S2-2、酶切原始載體；S2-3、將所述帶粘性末端的接頭引物退火后...

【專利技術屬性】
技術研發人員：袁定陽，段美娟，余東，孫志忠，譚炎寧，孫學武，袁光杰，袁貴龍，趙炳然，毛畢剛，韶也，李新奇，袁隆平，
申請(專利權)人：湖南雜交水稻研究中心，
類型：發明
國別省市：湖南,43