一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體涉及一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法。本發明專利技術根據高通量轉錄組測序篩選得到目的基因，通過PCR反應及PCR產物測序得到多個單核苷酸多態性位點。再由所有有效的單核苷酸多態性位點組成單倍體型用于分子標記以達到遺傳分型。本發明專利技術操作簡單、通量靈活、單核苷酸多態性標記遺傳穩定可靠，可在生物學、遺傳學研究中推廣應用，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。

【技術實現步驟摘要】
一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)，是指發生在染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。單核苷酸多態性是許多物種基因組中最常見的變異形式,在基因組中的分布頻率很高。據估計，在人類基因組中大約含有320萬個SNP位點，平均每1000個核苷酸就有一個以上的SNP；水稻第4號染色體每隔250bp左右就有一個SNP。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基，因此SNP通常被稱為二等位基因。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組中篩選SNPs往往只需要+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就有利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單個核苷酸多態性標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。在漫長的進化過程中，生物體形成了自身特有的DNA堿基序列，比較不同物種間或同一物種不同地方品種間的SNP差異，可以了解物種間的親緣關系和進化的生物信息學，從而對不同物種或同一物種不同地方的品種進行精細鑒定和分類。桑葉、桑椹、桑皮、桑根都是傳統的中藥材，在現有國家藥品標準中，含有這4味中藥的復方多達200種以上。桑葉具有降血糖、降血壓、降血膽固醇、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗毛細管滲透、利尿等功能。桑枝不僅是《中華人民共和國藥典》記載的祛風濕的常用藥，而且還具有抗炎、降糖、降血脂、提高機體免疫等功能。桑白皮首載于《神農本草經》，其味甘、性寒,能瀉肺平喘及行水消腫，主治肺熱、水腫、糖尿病及骨折等癥，桑白皮的提取液能明顯降低血壓，還有鎮靜作用。現代藥理學研究表明，桑椹具有調節免疫、降血糖、降脂、抗衰老、護肝、抗病毒等作用。目前，桑類中藥原植物均采用桑MorusalbaL.,但是，由于桑樹品種較為復雜，古今關于桑類中藥原植物的記述也不一致，而桑樹植物的分類學處理亦很頻繁；同時，由于桑樹植物易于自然雜交，人工雜交的品種亦層出不窮，亦可能導致桑類中藥原植物的復雜性。鑒于此，對桑類中藥的原植物的區分就尤為必要。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，能夠在現有桑樹品種復雜、桑樹分類處理頻繁及古今桑類中藥原植物記述不一致等情況下，通過獲得基因組的大量的核苷酸多態性標記，發現不同地方的桑樹品種之間存在的遺傳變異，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。本專利技術的技術方案：本專利技術所述基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，由以下步驟構成：(1)種群調查及取樣；(2)DNA提取；(3)測序；(4)篩選目標基因TR2222；(5)根據目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQIDNO:1所示；反向引物如序列表中SEQIDNO:2所示；(6)PCR擴增；(7)測序；(8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點。進一步地，所述目標基因TR2222是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。進一步地，所述PCR擴增的條件參數：94℃預變性5min、94℃30s、55℃30s、72℃1min，35個循環，72℃延伸10min。進一步地，所述目標基因TR2222在桑樹種群中有8個單核苷酸多態性位點，目標基因TR2222的基因片段如序列表中SEQIDNO:3所示，其中8個單核苷酸多態性位點分別位于13、115、201、297、384、386、486、551。進一步地，高通量轉錄組測序的方法：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度約為500bp，在IlluminaHiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。本專利技術的有益效果：自古以來，桑樹品種繁多，發展至今，我國桑樹種質資源多達三千余份。長期以來，國內外的學者為了更好的解決桑類的分類問題，已經提出了諸如數值分類、染色體分類、同工酶分類、DNA分子標記分類等分類方法，但這些方法都存在著一些缺點和不足。本專利技術一次實驗中，即可得到8個單核苷酸多態性SNP位點，提供了豐富的多態性信息。同時本專利技術的實驗條件簡單，成功率高，可重復性好。在實施過程中，實驗成功率在98％以上，實驗結果的可重復性更可達到100％。本專利技術采用的8個SNP位點，單倍體基因型理論上可以達到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態性信息，使結果更加準確。SNP標記遺傳穩定，可用于不同來源的樣本，適宜高通量自動化分析。本專利技術以廣東和江蘇兩個地方的桑樹品種為研究對象，在整個基因組內批量尋找單核苷酸多態性位點，全面評估桑樹植物品種的多樣性，為考證桑類中藥原植物提供有力技術支持。本專利技術在桑樹植物資源開發和利用等方面起著重要的作用，同時對桑樹遺傳資源的保護也具有重要意義。具體實施方式：下面結合具體樣本對本專利技術做進一步的詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。1.種群調查與取樣選擇廣東和江蘇兩個地方作為采樣點，選取生長良好、無蟲害的桑葉，采取后用保鮮袋裝好，立刻放入事先裝有冰袋的保溫盒中。帶回實驗室后立即提取基因組DNA。每個采樣點隨機取樣10株，避免重復采集同一樣品，記錄好樣品名字及采集地點。2.DNA提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，具體步驟基本按照試劑盒的說明書進行，稍作修改：(1)稱取0.05-0.1g新鮮葉片，放入已用液氮預冷的研缽中，用力快速研磨成粉末，在研磨過程中不要讓樣品解凍；(2)將研磨好的粉末小心轉移到預先加有450μlLPBuffer的1.5ml的離心管中，渦旋混勻；(3)65℃水浴30-60min，每隔10分鐘將樣品混勻一次，然后取出冷至室溫；(4)加入150μlDABuffer，混勻，然后冰上放置5min；(5)13000rpm離心10min，轉移上清至Shredderspincolumn中，13000rpm離心1min；(6)將濾液轉移到一個新的1.5ml的離心管中；(7)加入1.5倍濾液體積的PBindingBuffer，溫和顛倒混勻，管中出現絮狀沉淀，13000rpm離心10min；(8)轉移上清至Spincolumn，7500rpm離心1min，并棄濾液；(9)向Spincolumn中加入50μl的GBindingBuffer，12000rpm離心30秒，去除濾液；(10)向Spincolumn中加入600μl的WashBuffer，12000rpm離心30秒，去除濾液；(11)重復步驟(10)一次；(12)再次將Spincolumn于12000rpm離心1min，并將Spincolumn轉移至一個新的離心管；(13)向Spincolumn加入100-200μl65℃預熱的去離子水，室溫靜置2-3分鐘；(14)12000rpm離心1min，并棄Spincolumn，DNA存在于1.5ml的離心管中，-20℃保存備用。3.高通量轉錄組測序高通量測序不需要了解物種基因組信息，可以對任意物種進行轉錄組分析，并能測定每個轉錄本的片段序列，能夠精確到單核苷酸本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，其特征是由以下步驟構成：(1)種群調查與取樣；(2)DNA提取；(3)高通量轉錄組測序，其中，高通量轉錄組測序的方法為：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度為500bp，在Illumina?HiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列；(4)篩選種群的目標基因TR2222；(5)根據目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ?ID?NO:2所示；(6)PCR擴增，其中，PCR擴增體系為50μl：36.5μl?ddH

【技術特征摘要】
1.一種基于單核苷酸多態性標記的桑樹遺傳分型方法，其特征是由以下步驟構成：(1)種群調查與取樣；(2)DNA提取；(3)高通量轉錄組測序，其中，高通量轉錄組測序的方法為：提取樣本總RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分離mRNA，通過反轉錄反應合成雙鏈cDNA，構建轉錄組測序文庫，插入片段長度為500bp，在IlluminaHiSeq2500測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列；(4)篩選種群的目標基因TR2222；(5)根據目標基因TR2222設計引物，正向引物如序列表中SEQIDNO:1所示；反向引物如序列表中SEQIDNO:2所示；(6)PCR擴增，其中，PCR擴增體系為50μl：36.5μlddH2O、5μl10×...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊永華，廖永輝，湯程貽，方榮俊，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：江蘇,32