一種RHDV重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列為：上游引物F：如SEQ.ID.NO.1所示；下游引物R：如SEQ.ID.NO.2所示。一種兔出血癥病毒(RHDV)重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法：提取肝臟組織的RNA，利用上述特異性引物進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若能擴(kuò)增出317bp的條帶，則判斷為RHDV陽性，反之則為陰性。本發(fā)明專利技術(shù)的方法，最低檢出病毒量為0.1LD

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種RHDV重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法
本專利技術(shù)涉及一種生物檢測技術(shù)，具體涉及一種檢測兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物和重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，屬于分子生物學(xué)

技術(shù)介紹
兔出血癥是由兔出血癥病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)引起的一種高度接觸性、急性、致死性傳染病，常呈暴發(fā)性流行，對家兔飼養(yǎng)行業(yè)造成毀滅性的損失。RHDV的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，由約7437個(gè)核苷酸組成，基因組含有2個(gè)開放閱讀框架，衣殼蛋白VP60是主要的結(jié)構(gòu)蛋白。RHDV的常用檢測方法有血凝試驗(yàn)(HA)、反向間接血凝(IHA)、免疫擴(kuò)散法、熒光抗體法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、電鏡觀察法、RT-PCR法等。HA、IHA、免疫擴(kuò)散法等方便快捷，但敏感性較低,不適宜于微量病毒的檢測。ELISA、熒光抗體法較為成熟，但不及RT-PCR方法敏感。常規(guī)RT-PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，需要特殊的基因擴(kuò)增儀器。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。英國公司TwistDxInc以此為基礎(chǔ)開發(fā)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。RPA反應(yīng)的最適溫度在37℃～42℃，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行，這無疑能大大加快基因擴(kuò)增的速度。此外，由于不需要特殊的溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)提供了一種檢測兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物，以及重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，該方法具有簡便、快速、敏感性高、特異性好等優(yōu)勢，完全能夠滿足快速檢測RHDV的需要。本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種檢測兔出血癥病毒(RHDV)的特異性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列為：上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。所述引物所對應(yīng)的特異性擴(kuò)增片段位于RHDV參照基因(GenbankDQ205345)的第5301-5617位點(diǎn)之間，大小為317bp，其核苷酸序列為：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。一種兔出血癥病毒(RHDV)重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，為：提取肝臟組織的RNA，利用上述特異性引物進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若能擴(kuò)增出317bp的條帶，則判斷為RHDV陽性，反之則為陰性。優(yōu)選的，所述提取肝臟組織的RNA的具體方法如下：將肝臟組織用PBS以1∶10(w/v)研磨成懸液,裝入高壓滅菌處理過的1.5mLEP管中，于-80℃反復(fù)凍融3次，凍融后以9000×g離心10min，取上清液300μL于2mL離心管中，加入900μLTRIZOL試劑，劇烈顛倒6～10次，室溫靜置10min；加入200μL氯仿，上下顛倒60～100次，室溫靜置5min；4℃10000×g離心10min；取上清移入1.5mL離心管中，加等體積的異丙醇，輕輕搖勻，-20℃放置30min，4℃10000×g離心10min，倒掉上清；加入1mL75％乙醇溶液，4℃10000×g離心5min，去掉上清，在超凈工作臺(tái)中干燥5min，用適量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃凍存。優(yōu)選的，進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，按照TwistAmpDNAAmplificationKits試劑盒操作說明進(jìn)行，反應(yīng)體系為：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，RTBuffer29.5μL，Template10μL，ddH2O5.6μL；漩渦混勻，離心；加入2.5μL280mMMgAc，混勻。優(yōu)選的，進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增參數(shù)為：40℃15min后取出，冷卻至室溫；混勻后，離心，40℃35min。優(yōu)選的，所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為電泳：取5μLPCR產(chǎn)物加入2℅瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察。本專利技術(shù)的檢測RHDV的特異性引物，是根據(jù)RHDV的VP60基因序列設(shè)計(jì)的引物，并基于該特異性引物的性質(zhì)，本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化建立了適宜于快速準(zhǔn)確進(jìn)行RHDV檢測的等溫?cái)U(kuò)增基因方法，最低檢出病毒量為0.1LD50，靈敏度與傳統(tǒng)RT-PCR一致。該方法操作簡單、快速，適用于臨床生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。附圖說明圖1：兔出血癥病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增引物的優(yōu)化；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.3；2-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.2。圖2：兔出血癥病毒重組酶聚合酶等溫檢測特異性結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-兔出血癥病毒；2-巴氏桿菌；3-波氏桿菌；4-大腸桿菌；5-葡萄球菌；6-魏氏梭菌；7-兔肝臟。圖3：兔出血癥病毒重組酶聚合酶等溫檢測靈敏度結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3-10LD50；4-1LD50；5-0.1LD50；6-0.01LD50。圖4：兔出血癥病毒RT-PCR檢測靈敏度結(jié)果；其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3-10LD50；4-1LD50；5-0.1LD50；6-0.01LD50。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。實(shí)施例一1、引物設(shè)計(jì)常規(guī)RT-PCR所用引物長度一般18-25個(gè)，而RP引物的長度一般為30-35個(gè)核苷酸，引物過短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性，依據(jù)重組酶聚合酶的擴(kuò)增特性。通過對已有的大量RHDV基因序列進(jìn)行比對，參照RHDV基因序列(GenbankDQ205345)設(shè)計(jì)了3條保守引物，如下：SEQ.ID.NO.1：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’(34nt)；SEQ.ID.NO.2:5’-CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgT本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測兔出血癥病毒的特異性引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列為：上游引物F：5’?TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA?3’；如SEQ.ID.NO.1所示；下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT?3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測兔出血癥病毒的特異性引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列為：上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測兔出血癥病毒的特異性引物，其特征在于：所述引物所對應(yīng)的特異性擴(kuò)增片段位于RHDV參照基因的第5301-5617位點(diǎn)之間，大小為317bp，其核苷酸序列為：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。3.權(quán)利要求1或2所述的檢測兔出血癥病毒的特異性引物在檢測兔出血癥病毒中的應(yīng)用。4.一種兔出血癥病毒重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，其特征在于：提取肝臟組織的RNA，利用權(quán)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃兵，馬秀麗，于可響，姜亦飛，劉存霞，張連芝，龐玉倩，李玉峰，宋敏訓(xùn)，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：山東,37