一種破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：Ａ．血漿采集；Ｂ．調(diào)控血漿參數(shù)分步沉淀，過濾，得沉淀組分（１２３）；Ｃ．溶解組分（１２３），調(diào)控參數(shù)沉淀過濾得到上清液及沉淀組分（３）；Ｄ．調(diào)控步驟Ｃ中的上清液沉淀過濾得到沉淀組分２；Ｅ．溶解組分（２），調(diào)控參數(shù)沉淀過濾得到產(chǎn)物；Ｆ．病毒滅活；Ｇ．配液及分裝。本發(fā)明專利技術(shù)采用分步沉淀的方式，分兩步調(diào)控血漿參數(shù)并靜置分離，使不同的組分分別于最佳值較徹底地沉淀，沉淀量比一步沉淀法增加１．５～２倍，使產(chǎn)品的收率比傳統(tǒng)方法的收率提高了，免疫球蛋白的收率升高至８克／千克血漿，破傷風(fēng)抗體效價達(dá)到１１０ＩＵ／ｍｌ。（*該技術(shù)在2024年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種破傷風(fēng)抗體的人免疫球蛋白的生產(chǎn)方法。
技術(shù)介紹
破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，一直以來人類使用馬血清破傷風(fēng)病毒素(TAT)預(yù)防和治療破傷風(fēng)。TAT是含有高效價的破傷風(fēng)抗體的馬血清蛋白，由于是異源蛋白，因此TAT對人體有很強(qiáng)的過敏原性，注射后易發(fā)生過敏性休克甚至出現(xiàn)血清病。使用TAT必須做皮試，皮試陰性者在注射時仍有過敏反應(yīng)。大量臨床資料表明TAT引起過敏反應(yīng)的幾率在5～30％，其中約有萬分之一的致死率，因此使用TAT存在很大的不安全性。人體破傷風(fēng)免疫球蛋白(TIG)治療破傷風(fēng)，是經(jīng)乙肝疫苗接種后再經(jīng)破傷風(fēng)類毒素(TD)免疫的具有高效價破傷風(fēng)抗體的血漿，經(jīng)低溫乙醇法分級沉淀、加壓過濾分離提純，并經(jīng)病毒滅活處理的特異免疫球蛋白，用于防治破傷風(fēng)。采用TIG治療破傷風(fēng)，不僅能有效中和破傷風(fēng)患者體內(nèi)毒素，而且由于TIG提取自人血漿中，對患者沒有致過敏作用，因此作用安全。從人血漿中分離免疫球蛋白，經(jīng)典方法是E.J.Cohn教授創(chuàng)立的低溫乙醇分級沉淀技術(shù)，該技術(shù)通過有效控制蛋白質(zhì)沉淀的五個因素pH值、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度來逐級沉淀血漿中的不同蛋白質(zhì)。在低溫乙醇法分離血漿蛋白中，蛋白質(zhì)沉淀分離的傳統(tǒng)方法采用連續(xù)冷凍離心機(jī)分離工藝，該工藝要求操作溫度保持低溫，對能源消耗大而且對操作員身體健康不利，該工藝是間歇式操作，期間容易發(fā)生操作人員和制品的直接接觸導(dǎo)致污染，影響制品的抗體效價和產(chǎn)品質(zhì)量。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種能提高免疫球蛋白收率、降低能耗、并能保持蛋白中的高效價的破傷風(fēng)抗體的生產(chǎn)方法。為了達(dá)到上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法采用了以下技術(shù)方案(A)血漿采集；(B)將上述血漿融化混勻并調(diào)控pH至7.0～7.4，溫度-2～-3℃，酒精濃度6～10％，蛋白濃度5.0～5.2％、離子強(qiáng)度0.14～0.17，攪拌反應(yīng)30分鐘后，靜置；再次調(diào)整溶液的參數(shù)至pH6.8～6.9，溫度-4～-5℃，酒精濃度18～22％，蛋白濃度4.1～4.5％、離子強(qiáng)度0.12～0.14，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，靜置；在溶液中加入助濾劑，過濾，并沉淀得組分(123)；(C)組分(123)加冷蒸餾水溶解，并調(diào)控至pH5.1～5.2，溫度-3～-6℃，酒精濃度16～20％，離子強(qiáng)度0.14～0.16，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，過濾得到上清液及沉淀組分(3)；(D)調(diào)控步驟C中的上清液至pH7.0～7.6，溫度-8～-11℃，酒精濃度22～28％，離子強(qiáng)度0.045～0.055，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，過濾得到沉淀組分(2)；(E)對組分(2)進(jìn)行溶解，調(diào)控pH至5.0～5.5，溫度2～8℃，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，超濾濃縮；(F)病毒滅活；(G)配液及分裝。由于血漿蛋白存在多種組分，各種組分的等電點(diǎn)不同，其最佳沉淀的血漿參數(shù)(pH值、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度、乙醇濃度)，因此在同一血漿參數(shù)條件下各組分沉淀不完全。本專利技術(shù)采用了分步沉淀的方式，分兩步調(diào)控血漿參數(shù)并靜置分離，使不同的組分分別于最佳值較徹底地沉淀，沉淀量比一步沉淀法增加1.5～2倍，使產(chǎn)品的收率比傳統(tǒng)方法的收率提高了，免疫球蛋白的收率從傳統(tǒng)的5克/千克血漿升高至8克/千克血漿，破傷風(fēng)抗體效價達(dá)到110IU/ml。同時，采用本專利技術(shù)可以顯著地改善生產(chǎn)環(huán)境，車間溫度可以控制在0℃以上。采用壓縮空氣做過濾動力，大大降低了離心分離的能耗，也降低了操作人員的勞動強(qiáng)度，從離心分離的開放性操作變?yōu)槊荛]性操作，減少人與制品的直接接觸，提高了安全性，降低了生產(chǎn)成本，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。附圖說明圖1是本專利技術(shù)的工藝流程圖。具體實施例方式本專利技術(shù)的方法，依次包括以下步驟(A)血漿采集獻(xiàn)漿員經(jīng)破傷風(fēng)毒素免疫自體產(chǎn)生破傷風(fēng)抗體，采集抗體效價在8IU/ml以上的血漿，冷凍保存作生產(chǎn)原料；(B)制備組分123將上述血漿融化混勻后調(diào)控pH至7.0～7.4，溫度-2～-3℃，酒精濃度8％，蛋白濃度5.1％、離子強(qiáng)度0.15，攪拌反應(yīng)30分鐘以上并靜置2小時；再次調(diào)整溶液至pH6.8～6.9，溫度-4～-5℃，酒精濃度20％，蛋白濃度4.3％、離子強(qiáng)度0.14，攪拌反應(yīng)30分鐘以上并靜置2小時；按14克/毫升血漿的比例在溶液分別添加入硅藻土和珍珠巖，用隔膜泵注入壓濾機(jī)加壓過濾，壓濾完成后泵入洗液(1)循環(huán)沖洗，并用壓縮空氣吹干至無上清液流出為止，沉淀得到組分IV；(C)制備組分3組分IV加冷蒸餾水溶解，加水比例為0.75升水/千克血漿，攪拌溶解后調(diào)控至pH5.1～5.2，溫度-4～-5℃，酒精濃度18％，離子強(qiáng)度0.15，攪拌反應(yīng)30分鐘以上；壓濾機(jī)預(yù)先泵入含硅藻土的洗液，使硅藻土均勻分布到濾板上，然后泵入蛋白溶液加壓過濾，濾后用壓縮空氣吹干，所得的沉淀即組分III，上清液則用于后序分離組分II。(D)制備組分2調(diào)控上清液至pH7.3～7.5，溫度-9～-10℃，酒精濃度25％，離子強(qiáng)度0.05，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，然后直接泵入壓濾機(jī)加壓過濾，濾完后用壓縮空氣吹干到無上清液流出，所得沉淀即組分II。(E)對組分2進(jìn)行溶解，按1千克沉淀加5升水的比例加入冷蒸餾水溶解沉淀，調(diào)控至pH5.1～5.2，溫度3～7℃，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，用規(guī)格為NMWL50000的超濾器透析濃縮至比例為1千克沉淀4.5升水的濃度；(F)病毒滅活滅活罐內(nèi)蛋白液濃度控制在0.45～0.50％，按0.5千克/升蛋白液的比例加入山梨醇保護(hù)劑，調(diào)控pH5.0，在59.5～60.5℃下滅活10小時；(G)配液及分裝蛋白液濃度調(diào)整至18％以下，破傷風(fēng)效價控制在110IU/mL，pH6.55～6.65，經(jīng)0.2μm的除菌膜過濾分裝。權(quán)利要求1.，包括以下步驟(A)血漿采集；(B)將上述血漿融化混勻并調(diào)控pH至7.0～7.4，溫度-2～-3℃，酒精濃度6～10％，蛋白濃度5.0～5.2％、離子強(qiáng)度0.14～0.17，攪拌反應(yīng)30分鐘后，靜置，再次調(diào)整溶液的參數(shù)至pH6.8～6.9，溫度-4～-5℃，酒精濃度18～22％，蛋白濃度4.1～4.5％、離子強(qiáng)度0.12～0.14，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，靜置；加入助濾劑，過濾，得沉淀組分(123)；(C)制備組分(3)組分(123)加冷蒸餾水溶解，并調(diào)控至pH5.1～5.2，溫度-3～-6℃，酒精濃度16～20％，離子強(qiáng)度0.14～0.16，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，過濾得到上清液及沉淀組分(3)；(D)制備組分(2)調(diào)控步驟C中的上清液至pH7.0～7.6，溫度-8～-11℃，酒精濃度22～28％，離子強(qiáng)度0.045～0.055，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，過濾得到沉淀組分(2)；(E)對組分(2)進(jìn)行溶解，調(diào)控pH至5.0～5.5，溫度2～8℃，攪拌反應(yīng)30分鐘以上，超濾濃縮；(F)病毒滅活；(G)配液及分裝。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟B中所述的助濾劑為硅藻土和珍珠巖，均按14克每毫升血漿的比例加入進(jìn)溶液中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟B、C、D中所述的過濾是指用隔膜泵把待過濾溶液注入壓濾機(jī)加壓過濾，壓濾完成后泵入洗液(1)循環(huán)沖洗，用壓縮空氣吹干。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的破傷風(fēng)免疫本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種破傷風(fēng)免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：（Ａ）血漿采集；（Ｂ）將上述血漿融化混勻并調(diào)控ｐＨ至７．０～７．４，溫度－２～－３℃，酒精濃度６～１０％，蛋白濃度５．０～５．２％、離子強(qiáng)度０．１４～０．１７，攪拌反應(yīng)３０分鐘后 ，靜置，再次調(diào)整溶液的參數(shù)至ｐＨ６．８～６．９，溫度－４～－５℃，酒精濃度１８～２２％，蛋白濃度４．１～４．５％、離子強(qiáng)度０．１２～０．１４，攪拌反應(yīng)３０分鐘以上，靜置；加入助濾劑，過濾，得沉淀組分（１２３）；（Ｃ）制備組分（３）： 組分（１２３）加冷蒸餾水溶解，并調(diào)控至ｐＨ５．１～５．２，溫度－３～－６℃，酒精濃度１６～２０％，離子強(qiáng)度０．１４～０．１６，攪拌反應(yīng)３０分鐘以上，過濾得到上清液及沉淀組分（３）；（Ｄ）制備組分（２）：調(diào)控步驟Ｃ中的上清液至ｐＨ７． ０～７．６，溫度－８～－１１℃，酒精濃度２２～２８％，離子強(qiáng)度０．０４５～０．０５５，攪拌反應(yīng)３０分鐘以上，過濾得到沉淀組分（２）；（Ｅ）對組分（２）進(jìn)行溶解，調(diào)控ｐＨ至５．０～５．５，溫度２～８℃，攪拌反應(yīng)３０分鐘以上，超濾濃縮； （Ｆ）病毒滅活；（Ｇ）配液及分裝。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱光祖，梅偉伶，
申請(專利權(quán))人：三九集團(tuán)湛江開發(fā)區(qū)雙林藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：44[中國|廣東]