一種利用唾液檢測人體疲勞的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，包括提取收集唾液、向收集的唾液中加入吸附劑和蛋白酶抑制劑、檢測唾液中特定蛋白的含量等步驟，是通過檢測唾液中特定蛋白的含量來確定健康狀況。本發明專利技術屬于人體蛋白的檢測領域，是一種非侵入式的標志物檢測方法，不會破壞人體組織，其具有無創、無痛、快速的優點，具有重要社會意義和應用前景。

Method for detecting human fatigue by saliva

The invention discloses a method for detecting human fatigue by saliva, including the extraction content of saliva collection, added to the collection of saliva specific protein adsorption agent and protease inhibitors, detection in saliva and other steps, through the content of specific protein was detected in saliva to determine the health status. The invention belongs to the field of detection of human protein, is a sign of non-invasive detection method, no damage to the human body organization, which has the advantages of noninvasive, painless, fast, has important social significance and application prospect.

【技術實現步驟摘要】
一種利用唾液檢測人體疲勞的方法
本專利技術涉及一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，屬于蛋白質檢測

技術介紹
蛋白質約占人體全部質量的18％左右，其與生命活動現象緊密聯系在一起的物質。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸(Aminoacid)按不同比例組合而成的，并在體內不斷進行代謝與更新。在現有技術中，蛋白質的提取、檢驗更多的是采用例如：抽血等人體侵入式的提取方式。2008年，美國南加州大學的丹尼(Denny)等在《蛋白組學研究雜志》發表文章指出，人的唾液中有1166種蛋白質。其中大部分蛋白質能同時在血漿和淚液中找到。當時研究者就提出，從這些蛋白質中可以找到與疾病相關的生物標志物，從而為今后的臨床診斷提示一種新方式。隨后也有研究陸續發現，人唾液中的C反應蛋白、α-1B糖蛋白、肌酐等水平與心血管疾病、癌癥、腎臟病等相關。但是，迄今尚未建立一種無創、便捷的唾液中蛋白質提取和檢測技術。
技術實現思路
本專利技術需要解決的技術問題是如何提供一種非侵入式的用生物分子進行蛋白質檢測的方法。為解決上述技術問題，本專利技術所采用的技術方案是：A、提取收集疑似疲勞人體的唾液；B、向收集的唾液中加入吸附劑和蛋白酶抑制劑；C、檢測唾液中特定蛋白的含量。本專利技術技術方案的進一步改進在于：步驟A中提取唾液的具體方法是：先用生理鹽水漱口不少于兩次，再用清水漱口不少于兩次，然后收集唾液。本專利技術技術方案的進一步改進在于：每次漱口所用生理鹽水或清水的體積為20～30ml，每次的漱口時間為20～30s，漱口所用生理鹽水或清水的溫度為20～35℃。本專利技術技術方案的進一步改進在于：唾液收集量不小于0.1毫升。本專利技術技術方案的進一步改進在于：唾液收集后需要儲存在-80～-70℃下。本專利技術技術方案的進一步改進在于：步驟B中吸附劑為PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝膠的一種，蛋白酶抑制劑為亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑彈性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物，步驟C中的特定蛋白為核連蛋白-2、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、胃蛋白酶或金屬蛋白酶中的一種或者它們的組合。本專利技術技術方案的進一步改進在于：檢測唾液中蛋白的方法是：將唾液進行離心處理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白質提取劑后冷凍一段時間，得到冷凍液；將冷凍液進行離心處理，取出下層液并再次冷凍，得到蛋白干粉；將蛋白干粉溶于水化液中，并離心處理，得上清液Ⅱ并與NH4HCO3溶液混合，再次離心處理后向得到的上清液中加入胰酶并控溫消化酶解，然后進行分子標記并測得蛋白的含量。由于采用了上述技術方案，本專利技術取得的技術進步是：本專利技術是通過特定方法提取人體唾液進行蛋白質檢測，是一種非侵入式的生物分子檢測方法，不會破壞人體組織，其具有無創、無痛、快速的優點。唾液作為體液之一，隨時都可以方便地收集到，無創、無痛。其適用于人體，也可以延伸到動物體等。實施本專利技術的方法可以將唾液作為人體健康狀況的一面鏡子，以唾液作為診斷用介質，本專利技術的方法可以在多種環境下進行并提供有價值的診斷信息，甚至可以用于HIV、HBV病毒以及各種藥物如可卡因、酒精的檢測。本專利技術的方法剛剛起步，有關檢測的靈敏性、特異性、重復性以及與現有診斷標準的相關性還有待進一步完善。盡管如此，唾液仍是具有極大科研和臨床潛力的生物液。專利技術人相信隨著唾液檢測的研究工作的不斷深入，其應用將會實現由疾病診斷到健康監控的轉變。將唾液中的蛋白作為臨床標志物進行檢測，可以用來協助疾病的診斷。唾液中的某些蛋白發生疾病特異的改變，使得這些唾液中的蛋白有成為疾病特異生物標志物的潛力。未來，通過檢測人體中特定蛋白質的即時含量，以建立疾病的快速識別方法。對有效預防和減少因疲勞導致的生命和安全隱患，造福人民意義重大。本專利技術利用了人體的唾液等體液成分，在飛行時間質譜檢測時的2000～15000Da范圍內可以獲得良好的肽譜識別，并且多肽的檢出與疲勞間呈現一定規律性；同時，利用唾液中蛋白質具有易得性和易檢測性，便于對人體的健康狀態進行測定。本專利技術的方法可以利用非侵入的方式大量獲得基本可溶的肽段和蛋白質，唾液收集時要先用生理鹽水漱口三次，再用清水漱口三次，然后才可收集唾液，這樣可以大幅度減少唾液中其他雜質的對檢測結果的干擾，此收集方法優于刷牙等其它收集方式。收集唾液后利用質譜或其它物理化學方法對唾液樣品中的蛋白進行鑒定，可以測定特定蛋白的含量，可以作為檢測人體健康狀況的判定依據，而高通量的液相-質譜聯用方法測得的結果更加精確。檢測過程中體液收集量小，方便取得、儲存和保藏。在-80～-70℃下儲藏不會使唾液中的蛋白質的含量發生變化。本專利技術在提取唾液后向唾液中加入了吸附劑，提高了唾液中蛋白質的濃度，減少了樣品的體積，更加便于進一步的純化；同時，蛋白酶抑制劑的加入破碎細胞提取蛋白質的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質不被降解，防止了蛋白水解。本專利技術將唾液特定蛋白作為健康標志物，可以做到非侵入的方式獲取，經過胰酶酶解后的肽段和蛋白質基本可溶并且可以利用TMT試劑對蛋白進行標記，易保存，具有廣泛的應用前景。具體實施方式下面對本專利技術做進一步詳細說明：一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，包括以下步驟，A、提取收集疑似疲勞人體的唾液；唾液來自于人體，其提取唾液的具體方法是：先用生理鹽水漱口不少于兩次，再用清水漱口不少于兩次，每次漱口所用生理鹽水或清水的體積為20～30ml，每次的漱口時間為20～30s，漱口所用生理鹽水或清水的溫度為20～35℃，然后收集唾液，收集量不小于0.1毫升，唾液收集后需要儲存在-80～-70℃下。B、向收集的唾液中加入吸附劑和蛋白酶抑制劑，其中吸附劑為PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝膠的一種或者它們的組合，蛋白酶抑制劑為亮肽素、抗痛素、糜蛋白酶抑素、抑彈性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素的混合物。C、檢測唾液中特定蛋白的含量，具體方法為：將唾液進行離心處理得到上清液Ⅰ，向上清液Ⅰ中滴入蛋白質提取劑后冷凍一段時間，得到冷凍液；將冷凍液進行離心處理，取出下層液并再次冷凍，得到蛋白干粉；將蛋白干粉溶于水化液中，并離心處理，得上清液Ⅱ并與NH4HCO3溶液混合，再次離心處理后向得到的上清液中加入胰酶并控溫消化酶解，然后進行分子標記并測得蛋白的含量。特定蛋白核連蛋白-2、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、胃蛋白酶或金屬蛋白酶中的一種或者它們的組合。本專利技術通過檢測唾液中特定蛋白的含量確定是否處于健康狀態。實施例：疲勞是誘發多種疾病的根源，下面以測定唾液中的核連蛋白-2含量與人體疲勞狀況為例對本專利技術做進一步做詳細說明，具體方法如下：A、提取收集疑似疲勞人體的唾液首先，在收集唾液前一般用生理鹽水漱口三次，再用清水漱口三次，用生理鹽水和清水漱口每種不應少于兩次，每次漱口所用生理鹽水或清水的體積可以在20～30ml之間的任一數值，以口腔能夠靈活運動為好，每次的漱口時間大概在25s左右，可以取20～30s的任一數值，漱口所用的生理鹽水或清水溫度可以是口感舒適的20～35℃，如30℃左右。然后將舌上翹或者做咀嚼運動，使唾液在下頜部積聚，通過下唇收縮，使得唾液順著下唇形成的通道自然流本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：包括以下步驟，A、提取收集疑似疲勞人體的唾液；B、向收集的唾液中加入吸附劑和蛋白酶抑制劑；C、檢測唾液中特定蛋白的含量。

【技術特征摘要】
1.一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：包括以下步驟，A、提取收集疑似疲勞人體的唾液；B、向收集的唾液中加入吸附劑和蛋白酶抑制劑；C、檢測唾液中特定蛋白的含量。2.根據權利要求1所述的一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：步驟A中提取唾液的具體方法是：先用生理鹽水漱口不少于兩次，再用清水漱口不少于兩次，然后收集唾液。3.根據權利要求2所述的一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：每次漱口所用生理鹽水或清水的體積為20～30ml，每次的漱口時間為20～30s，漱口所用生理鹽水或清水的溫度為20～35℃。4.根據權利要求2所述的一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：唾液收集量不小于0.1毫升。5.根據權利要求4所述的一種利用唾液檢測人體疲勞的方法，其特征在于：唾液收集后需要儲存在-80～-70℃下。6....

【專利技術屬性】
技術研發人員：許巖麗，劉志軍，趙朝賢，李焰，丁敏，蘇現輝，劉鳳麗，熊南雁，王雪玲，劉小霞，席愛萍，
申請(專利權)人：河北工程大學，
類型：發明
國別省市：河北,13