制備強熒光藻藍蛋白的方法技術

本發(fā)明專利技術制備強熒光藻藍蛋白的方法是以新鮮藻泥為原料，用含ＥＤＴＡ的磷酸緩沖液洗滌，經(jīng)超聲波破碎細胞，釋放出色素蛋白，通過離心分離，去除不溶性細胞膜及細胞器。收集上清液，經(jīng)分級鹽析，收集藻藍蛋白沉淀。沉淀溶于含ＥＤＴＡ的磷酸緩沖液中，通過ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５脫鹽，上ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱，去掉堿性雜質蛋白，然后上羥基磷灰石柱，獲得藻藍蛋白洗脫液。接著上ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱，去掉酸性雜質蛋白。最后再上第二次羥基磷灰石，獲得高純度強熒光的藻藍蛋白。本發(fā)明專利技術既省力又省時，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及。
技術介紹
藻藍蛋白(Phycocyanin，PC)是紅藍藻等海藻中重要的捕光色素蛋白藻膽蛋白組成部分，由α，β兩種亞基構成，其分子量約為34000-36000道爾頓，在280nm和360nm處具有特異性熒光激發(fā)峰，在650nm具熒光吸收峰。藻藍蛋白具有提高人體免疫力，促進動物血細胞再生等功能，能抑制癌細胞生長，對癌細胞有很強的殺傷力，是一種無毒無副作用的理想光敏劑，可減輕腫瘤化療的副作用。藻藍蛋白作為一種天然色素，色調(diào)為極美麗的天藍色，也可作為高級天然色素應用于食品和化妝品中。藻藍蛋白由于還具有強烈的熒光性，在分子生物學上可用于制備熒光探針，適用于免疫學、細胞學、生理學和分子生物學等方面的研究。此外，藻藍蛋白可用于信電產(chǎn)品中的光子開關，利用色素蛋白在一定波長光照下的蛋白構象變化快速開關電路，適用作高速通信元件。基于藻藍蛋白獨特的理化性質，因而其在科研、醫(yī)療、信電、保健、食品等領域有著廣泛的應用，是一種急待開發(fā)和推廣應用的生物活性制品。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供。本專利技術方法以新鮮藻泥為原料，用含EDTA的磷酸緩沖液洗滌，經(jīng)超聲波破碎細胞，釋放出色素蛋白，通過高速冷凍離心分離，去除不溶性細胞膜及細胞器。收集上清液，經(jīng)分級鹽析，收集藻藍蛋白沉淀。沉淀溶于含EDTA的磷酸緩沖液中，通過Sephadex G-25脫鹽，上DEAE-Sepharose FF柱，去掉堿性雜質蛋白，然后上羥基磷灰石柱，獲得藻藍蛋白洗脫液。接著上CM-Sepharose FF柱，去掉酸性雜質蛋白。最后再上第二次羥基磷灰石，獲得高純度強熒光的藻藍蛋白，經(jīng)冷凍干燥獲得藍色凍干粉。全部生產(chǎn)過程需控制在低溫條件(0～4℃)下操作，以保持熒光藻藍蛋白的分子空間構象和生物學活性。本專利技術方法包括以下步驟1)新鮮藻泥加入pH值7.0-7.6、濃度50mmol/L、含0.1～0.5mmol/LEDTA的磷酸緩沖液，冰浴超聲波破，將破碎液離心后去沉淀，收集上清液；2)分級鹽析上清液，量取上清液體積，按30％飽和(NH4)2SO4計算用量，緩慢加入上清液中，加畢后靜置8～12小時，離心、取上清，上清液再緩慢加至55％飽和度(NH4)2SO4，靜置10小時以上，離心、留沉淀備用；3)沉淀物用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25柱脫鹽，用10mmol/L、pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液洗脫，收集熒光藻藍蛋白部分；4)脫鹽后的熒光藻藍蛋白上預先用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸緩沖液作線性梯度洗脫，流速控制在5～10ml/min，收集熒光藻藍蛋白部分；5)將步驟4)收集的熒光藻藍蛋白部分上羥基磷灰石柱，用pH值7.0～7.6、濃度10～100mmol/L的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在620nm處的熒光藻藍蛋白部分；6)將步驟5)收集液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5～6、濃度10～200mmol/L的乙酸緩沖液作梯度洗脫，收集熒光藻藍蛋白部分；7)將步驟6)收集的熒光藻藍蛋白部分再上羥基磷灰石柱，以pH值7.0～7.6、濃度10～100mmol/L的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在620nm處的熒光藻藍蛋白部分；8)將步驟7)收集的熒光藻藍蛋白部分上Sephadex G-100柱，用10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸緩沖液洗脫，控制流速在5～10ml/min，收集熒光藻藍蛋白部分，經(jīng)A620/280雙波長檢測，將色價比達4.5以上的熒光藻藍蛋白液用聚乙二醇20000濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍、干燥，得本專利技術強熒光藻藍蛋白。本專利技術采用了Sephadex G-25層析柱動態(tài)脫鹽，既省力又省時，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。采用鮮藻作原料，工藝中始終在低溫(0～4℃)下操作制備出的是一種具生物活性的藍色熒光藻藍蛋白(FPC)，它與用藻粉制備的無熒光、或弱熒光藻藍蛋白有根本的區(qū)別。本專利技術制備出的藍色熒光藻藍蛋白是一種高純度(A620/A280＞4.5)的產(chǎn)品。具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本專利技術，但本專利技術的內(nèi)容并不局限于此實施例。脫鹽后的熒光藻藍蛋白上預先用濃度pH值7.6、10mmol/L、含0.5mmol/LEDTA的磷酸緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的pH值7.6、10mmol/L的磷酸緩沖液作線性梯度洗脫，控制流速在5～10ml/min，收集的熒光藻藍蛋白液上羥基磷灰石柱，用pH值7.6、濃度10～100mmol/L的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在620nm處的熒光藻藍蛋白部分，收集的熒光藻藍蛋白液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5.5、濃度10～200mmol/L的乙酸緩沖液作梯度洗脫，然后將收集的熒光藻藍蛋白再上一次羥基磷灰石柱，以pH值7.6、濃度10～100mmol/L的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在620nm處的熒光藻藍蛋白部分，最后將收集的熒光藻藍蛋白液上Sephadex G-100柱，用10mmol/L，pH值7.6的磷酸緩沖液洗脫，控制流速在5～10ml/min，收集熒光藻藍蛋白部分。經(jīng)A620/280雙波長檢測，色價比達4.5以上即為合格產(chǎn)品。G-100收集的熒光藻藍蛋白液用聚乙二醇20000濃縮，濃縮液置冷凍室冷凍，然后置于冷凍干燥機上，干燥成藍色粉末，總重量1800mg，A620/A280＞4.5。權利要求1.，其特征是控制溫度在0～4℃下，包括以下步驟1)新鮮藻泥加入pH值7.0-7.6、濃度50mmol/L、含0.1～0.5mmol/LEDTA的磷酸緩沖液，冰浴超聲波破，將破碎液離心后去沉淀，收集上清液；2)分級鹽析上清液，量取上清液體積，按30％飽和(NH4)2SO4計算用量，緩慢加入上清液中，加畢后靜置8～12小時，離心、取上清，上清液再緩慢加至55％飽和度(NH4)2SO4，靜置10小時以上，離心、留沉淀備用；3)沉淀物用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液溶解，上Sephadex G-25柱脫鹽，用10mmol/L、pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液洗脫，收集熒光藻藍蛋白部分；4)脫鹽后的熒光藻藍蛋白上預先用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～0.5mol/LNaCl的10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸緩沖液作線性梯度洗脫，流速控制在5～10ml/min，收集熒光藻藍蛋白部分；5)將步驟4)收集的熒光藻藍蛋白部分上羥基磷灰石柱，用pH值7.0～7.6、濃度10～100mmol/L的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在620nm處的熒光藻藍蛋白部分；6)將步驟5)收集液再上CM-Sepharose FF柱，用pH值5～6、濃度10～200m本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
制備強熒光藻藍蛋白的方法，其特征是控制溫度在０～４℃下，包括以下步驟： １）新鮮藻泥加入ｐＨ值７．０－７．６、濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ、含０．１～０．５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的磷酸緩沖液，冰浴超聲波破，將破碎液離心后去沉淀，收集上清液； ２）分級鹽析上清液，量取上清液體積，按３０％飽和（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］計算用量，緩慢加入上清液中，加畢后靜置８～１２小時，離心、取上清，上清液再緩慢加至５５％飽和度（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］，靜置１０小時以上，離心、留沉淀備用； ３）沉淀物用１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０～７．６、含０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ的磷酸緩沖液溶解，上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱脫鹽，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值７．０～７．６、含０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ的磷酸緩沖液洗脫，收集熒光藻藍蛋白部分； ４）脫鹽后的熒光藻藍蛋白上預先用１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值７．０～７．６、含０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ的磷酸緩沖液平衡的ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱，用含０～０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值７．０～７．６的磷酸緩沖液作線性梯度洗脫，流速控制在５～１０ｍｌ／ｍｉｎ，收集熒光藻藍蛋白部分； ５）將步驟４）收集的熒光藻藍蛋白部分上羥基磷灰石柱，用ｐＨ值７．０～７．６、濃度１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在６２０ｎｍ處的熒光藻藍蛋白部分； ６）將步驟５）收集液再上ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ柱，用ｐＨ值５～６、濃度１０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ的乙酸緩沖液作梯度洗脫，收集熒光藻藍蛋白部分； ７）將步驟６）收集的熒光藻藍蛋白部分再上羥基磷灰石柱，以ｐＨ值７．０～７．６、濃度１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液作梯度洗脫，收集吸收峰在６２０ｎｍ處的熒光藻藍蛋白部分； ８）將步驟７）收集的熒光藻藍蛋白部分上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值７．０～７．６的磷酸緩沖液洗脫，控制流速在５～１０ｍｌ／ｍｉｎ，收集熒光藻藍蛋白部分，經(jīng)Ａ６２０／２８０雙波長檢測，將色價比達４．５以上的熒光藻藍蛋白液用聚乙二醇２００００濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍、干燥，得本專利技術強熒光藻藍蛋白。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：龔興國，曾冬云，徐飛虎，周遠，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發(fā)明
國別省市：86[中國|杭州]