一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法技術

本發明專利技術公開了一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，包括胚性愈傷組織的誘導、增殖，體細胞胚的成熟、萌發和轉化；所述的體細胞胚的成熟培養采用液—固增殖?固成熟方式進行。本發明專利技術的高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，以抗松材線蟲病赤松的未成熟合子胚為外植體，通過對抗病赤松未成熟合子胚已成功誘導獲得的胚性愈傷組織進行體細胞胚成熟、萌發與植株再生等試驗，成功獲得了成熟的體細胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培養基上產生體細胞胚的萌發率和植株轉化率高，分別為67.2%和46.5%，為抗病赤松的大規模繁殖和工廠化生產提供了重要的科學依據和技術支撐。

High synchronization method for somatic embryogenesis and plant regeneration of pine wood nematode resistant pine wood disease

The invention discloses a method and plant regeneration of pine wood nematode of pine somatic embryos in a high synchronization occurs, including the induction and proliferation of embryogenic callus, somatic embryo maturation, germination and conversion of somatic embryos; the maturation of the liquid solid solid mature way of proliferation. Method and plant regeneration of pine wood nematode of pine somatic embryo high synchronization of the invention to the occurrence of pine pine wood nematode of immature zygotic embryos as explants, the disease resistant pine has been successfully induced from immature zygotic embryos of embryogenic callus to somatic embryo maturation, germination and plant regeneration test. Success of the mature somatic embryos and regenerated plants, and the transplanting survival, maturation of somatic embryos produced in plants based on the germination rate and high conversion rate, respectively 67.2% and 46.5%, to provide a scientific basis and technical support for the large-scale breeding and disease resistant pine factory production.

【技術實現步驟摘要】
一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法
本專利技術屬于樹木育種
，具體涉及一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法。
技術介紹
赤松(Pinusdensiflora)，主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯東南部及我國東部，可作庭院、荒山造林的樹種，但易感染松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)而大量死亡，對林業生產和生態環境造成了嚴重破壞。由于常規種苗繁殖系數低，選育出的抗病材料難以滿足大規模林業生產的需求。為了大量快速繁殖已選優良抗病基因型，在短時間內實現規?；a，對赤松離體組織培養技術的研究顯得尤為重要。體細胞胚胎發生具有繁殖系數大、周期短、結構完整、再生率高、不受季節影響等特點(Guptaetal,1993)，是植物大規模無性繁殖的一種主要手段(汪小雄等，2006；StasollaandYeung,2003)。國內外學者已通過體細胞胚胎發生成功獲得50多種針葉樹體細胞胚或體細胞胚再生植株(孫志強等，2010)，其中火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和輻射松(Pinusradiata)等樹種體細胞胚發生已經應用于規?；a(張守攻，2004)。Taniguchi(2001)首次對日本赤松體細胞胚胎發生進行研究，建立了胚性細胞系和進行體細胞胚胎成熟試驗，但轉化率非常低；隨后，Maruyama等(2005)、Maruyama和Hosoi(2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈傷組織增殖、體細胞胚胎成熟、萌發及轉化的影響因子，但存在胚性愈傷組織誘導率低、胚性愈傷組織能力的喪失，體胚成熟與轉化率低等問題。而國內外目前對赤松組織培養器官發生植株再生有所研究(朱麗華等，2010；李清清，2012)。目前國內關于赤松體細胞胚胎發生的研究報道很少(吳靜等，2015)。
技術實現思路
專利技術目的：針對現有技術中存在的不足，本專利技術的目的是提供一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，為抗病赤松體細胞胚胎發生條件進行優化以提高其體細胞胚胎的質量和數量，從而來提高萌發率和植株轉化率，為抗性赤松的種質資源保存、基因轉化、體胚苗的工廠化生產提供可行的技術支撐。技術方案：為實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案為：一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，包括胚性愈傷組織的誘導、增殖，體細胞胚的成熟、萌發和轉化；所述的體細胞胚的成熟培養采用液—固增殖-固成熟方式進行。所述的液—固增殖-固成熟為：取生長良好的胚性愈傷組織，轉入不含激素的DCR液體培養基中，劇烈震蕩形成良好的懸浮體系，取培養好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，用脫脂棉吸取水分，待水分瀝干后，將有培養物的濾紙放入配制好的固體增殖培養基中，15天之后轉入固體成熟培養基中。所述的體細胞胚的萌發為：將誘導的成熟體細胞胚22#-1水平置于萌發培養基上進行萌發，萌發培養基為LP，添加20g/L麥芽糖，2g/LAC，3g/L植物凝膠，pH5.8；非直射光培養4-7天，再放入直射光下培養14-17天；然后將萌發的體細胞胚轉入WPM基本培養基，附加1.5mg/LIBA，0.2mg/LNAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉膠，光照培養1個月。所述的體細胞胚的轉化為：待再生植株根伸長2cm后進行移栽，移栽前7d逐漸將封口膜揭開，使幼苗適應外界的環境，移栽時將幼苗根部的卡拉膠小心洗掉，移栽在珍珠巖、苗圃土和河沙構成1：1：2的基質中，移苗一個月內注意保持空氣濕度、溫度和基質濕度的穩定，3個月后移栽成活。在所述的體細胞胚的成熟培養中，培養基中添加15mg/LABA和140g/LPEG8000。在所述的體細胞胚的成熟培養中，培養基中添加8g/L肌醇。在所述的體細胞胚的成熟培養中，培養基中添加60g/L麥芽糖。在所述的體細胞胚的成熟培養中，培養基中添加3g/L植物凝膠。有益效果：與現有技術相比，本專利技術的高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，以抗松材線蟲病赤松的未成熟合子胚為外植體，通過對抗病赤松未成熟合子胚已成功誘導獲得的胚性愈傷組織進行體細胞胚成熟、萌發與植株再生等試驗，成功獲得了成熟的體細胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培養基上產生體細胞胚的萌發率和植株轉化率高，分別為67.2％和46.5％，再生植株3個月移栽成活率為32.7％。為抗病赤松的大規模繁殖和工廠化生產提供了重要的科學依據，為抗性赤松的種質資源保存、基因轉化、體胚苗的工廠化生產提供可行的技術支撐。附圖說明圖1是不同糖類對抗病赤松體細胞胚成熟的影響結果圖；圖2是肌醇濃度對抗病赤松體細胞胚成熟的影響結果圖；圖中：J1為肌醇0g/L，J2為肌醇2g/L，J3為肌醇4g/L，J4為肌醇6g/L，J5為肌醇8g/L，J6為10g/L，J7為肌醇16g/L；圖3是抗病赤松體細胞胚胎成熟、萌發及植株再生結果圖；圖中，A1，A2：正常子葉胚；B1，B2：畸形子葉胚；C1；C2：萌發培養基中5d后的體細胞胚；C3：萌發培養基中20d后體細胞胚形成的再生植株；D1，D2：WPM培養基中壯苗的再生植株；E1，E2：WPM培養基中壯苗1個月的再生植株；F1，F2：WPM培養基中壯苗3個月的再生植株；G1：移栽后體細胞胚苗；G2：移栽后3個月體細胞胚苗。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術做進一步的說明。以下實施例所使用的材料為：抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江蘇句容林場抗松材線蟲病赤松種質資源庫(2004年2月從日本林木良種繁育中心引種建立)，從球果中剝離出未成熟合子胚，誘導出具有胚性的愈傷組織(22#-1和13#-1)，并已繼代培養7次，再經過3次繼代培養，將胚性愈傷組織生長狀況良好的兩個無性系22#-1和13#-1作為體細胞胚胎發生的材料(吳靜，朱麗華，許建秀，吳小芹，葉建仁.抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導及增殖.南京林業大學學報，2015，39(1)：17-21)。以下實施例的結果數據采用Excel2007處理，用SPSS17.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗。實施例1ABA濃度(10、15、20mg/L)、PEG(聚乙二醇)8000濃度(100、140、180g/L)進行兩因素隨機區組試驗。將22#-1的胚性胚柄團(embryonicsuspensormass，ESM)轉接至設計的培養基(基本培養基LP，另附加肌醇8g/L，麥芽糖60g/L，MES250mg/L，CH500mg/L，VC10mg/L，谷氨酰胺450mg/L，活性炭(AC)2.0g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中，每處理30塊ESM，重復3次，實時觀察體胚的成熟情況。培養基。培養基用高壓滅菌121℃20min。抗病赤松體細胞胚胎誘導、增殖和成熟試驗在培養溫度設定為23±2℃的組培室中，暗培養，每兩個星期觀察一次。正常體細胞胚數即每克愈傷組織形成體細胞胚數(個/g)＝正常體細胞胚個數/愈傷組織鮮質量，畸形體細胞胚數即每克愈傷組織形成體細胞胚數(個/g)＝畸形體細胞胚個數/愈傷組織鮮質量，體細胞胚數即每克愈傷組織形成體細胞胚數(個/g)＝體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，包括胚性愈傷組織的誘導、增殖，體細胞胚的成熟、萌發和轉化；其特征在于：所述的體細胞胚的成熟培養采用液—固增殖?固成熟方式進行。

【技術特征摘要】
1.一種高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，包括胚性愈傷組織的誘導、增殖，體細胞胚的成熟、萌發和轉化；其特征在于：所述的體細胞胚的成熟培養采用液—固增殖-固成熟方式進行。2.根據權利要求1所述的高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，其特征在于：所述的液—固增殖-固成熟為：取生長良好的胚性愈傷組織，轉入不含激素的DCR液體培養基中，劇烈震蕩形成良好的懸浮體系，取培養好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，用脫脂棉吸取水分，待水分瀝干后，將有培養物的濾紙放入配制好的固體增殖培養基中，15天之后轉入固體成熟培養基中。3.根據權利要求1所述的高同步化的抗松材線蟲病赤松體細胞胚胎發生及植株再生方法，其特征在于：所述的體細胞胚的萌發為：將誘導的成熟體細胞胚22#-1水平置于萌發培養基上進行萌發，萌發培養基為LP，添加20g/L麥芽糖，2g/LAC，3g/L植物凝膠，pH5.8；非直射光培養4-7天，再放入直射光下培養14-17天；然后將萌發的體細胞胚轉入WPM基本培養基，附加1.5mg/LIBA，0.2mg/LNAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉膠...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳小芹，許建秀，葉建仁，吳靜，朱麗華，潘珺，
申請(專利權)人：南京林業大學，
類型：發明
國別省市：江蘇,32