一種降低深低溫凍存組織器官冰晶損傷的方法技術

本發明專利技術提供了一種?降低深低溫凍存組織器官冰晶損傷的方法，本發明專利技術提供的這種低溫凍存器官的處理方法，在器官待冷凍前使用干細胞條件培養基灌注，提高了組織細胞的生存狀態，增加了抗凋亡能力，減少了細胞在離體后發生的氧化應激損傷；在復蘇后立即使用含鮮活間充質干細胞的完全培養基進行后灌注處理，對凍存過程中受到冷凍保護劑毒性和滲透損傷的細胞進行主動修復，可有效減少細胞凋亡比率，減少組織結構的破壞。

Method for reducing ice crystal damage of deep frozen tissues and organs

The present invention provides a method for reducing cryopreservation of tissues and organs of ice damage, frozen storage organs for the low temperature processing method provided by the invention, the organ to be frozen before the use of stem cell conditioned medium perfusion, improve cell survival status, increase the ability of anti apoptosis, reduce oxidative stress injury cells in vitro after cultured in immediately after resuscitation; containing fresh mesenchymal stem cell medium perfusion after treatment, to the cryopreservation process by cryoprotectant toxicity and osmotic injury of cells to repair, can effectively reduce the apoptosis rate, reduce the damage of tissue structure.

【技術實現步驟摘要】
一種降低深低溫凍存組織器官冰晶損傷的方法
本專利技術屬于臨床醫學的器官組織深低溫凍存領域，公開了在器官組織深低溫凍存前后，使用間充質干細胞及其分泌產物灌注，從而達到減少細胞凋亡、降低冰晶對細胞膜損害的一種預處理和后處理的方法。
技術介紹
器官移植是治療嚴重器官衰竭的最終手段，但是供體捐獻和受體準備總是存在時間和空間的差異，因此，進一步開發更安全長效的器官冷凍保存——復蘇方法成了亟待解決的問題。生物組織的冷凍凍存過程包括冷凍保護劑的灌注、程控降溫，深低溫儲存，復蘇解凍及冷凍保護劑的置換清洗。每個步驟都影響著冷凍后器官中細胞的存活率及組織結構功能的保持。1972年，Mazur等首先從中國倉鼠組織培養細胞低溫凍存的實驗中，提出冷凍損傷的兩因素假說。一是溶質損傷效應，是指冷卻速度過慢，導致細胞外溶質濃度升高。二是機械損傷效應，是指冷卻速度過快，細胞內形成冰晶直接損傷細胞的膜結構。為了降低凍存對細胞的破壞，現在多使用玻璃化凍存，使液體粘稠度提高，在冷凍固化過程中減少內部晶體形成。溶液實現玻璃化主要靠提高冷卻速率和增加溶液濃度，這就需要使用冷凍保護劑。但是，冷凍保護劑本身也會對細胞造成損傷，高濃度保護劑會對細胞和組織形成毒性作用，而在復溫后洗脫的過程中還會造成細胞膜內外的滲透壓差，形成滲透損傷。因此，當今深低溫研究的重點就在于減少玻璃化過程中冷凍保護劑的損害。現有實驗的方向主要有改善導入和洗脫方式，使用“連續導入法”；加快保護劑滲透的“負壓浸漬技術”；使用不同種類冷凍保護劑使其相互稀釋的復配技術。但是，冷凍保護劑除了自身特性外，在不同細胞組織中的保護和毒性作用也不盡相同。而器官并不是多種細胞的簡單集合，作為結構復雜的復合組織，其降溫過程中各部分溫度分布不均勻導致的冷卻速率的差異和各種細胞對冷凍保護劑的敏感性不同使其低溫凍存的難度大為增加。因此，尋找新的組織細胞冷凍保護方法及修復損傷的方法極為重要。
技術實現思路
為了解決以上技術問題，本專利技術提供了一種在冷凍凍存器官過程中，應用臍帶間充質干細胞及其條件培養基進行組織內預灌注和后灌注的方法，可有效的提高組織的自我修復能力，有效提高復蘇后組織內活細胞的比例，使組織器官在復溫后更好的恢復功能。本專利技術涉及的器官深低溫凍存方法，包括以下步驟：1)將待冷凍的器官連接預冷至4℃的梯度濃度混合程控降溫器官灌注儀，灌注25℃恒溫的間充質干細胞條件培養基，灌注時間為30-60min；所述間充質干細胞條件培養基為傳代5代內脂肪、臍帶、臍血或骨髓中的一種的間充質干細胞，在傳代后24h后長到70~80%匯合，更換無血清間充質干細胞培養基，48h后收集的培養上清，經1000~3000g離心10~30min，取上清后使用0.1μm~0.22μm微孔濾膜過濾后所得；2）然后向器官灌注預冷至4℃的冷凍保護劑，灌注時長30min；3）將處理完畢的器官放入冷凍袋，封口后置于程控降溫儀中，按照設定降溫程序進行程序化降溫，待其溫度降至-80℃后投入液氮中存放；所述程控降溫儀降溫程序設定為①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min；4）復蘇器官時，將凍存器官自液氮取出后置于37℃水浴中，不斷搖動；5）完全融化后再次進行灌注，灌注液為12-25℃的含間充質干細胞條件培養基，灌注時間為30min-60min；處理完成的器官可直接進行移植。所述間充質干細胞條件培養基，細胞密度為1x107/L，灌注速度為1.5ml/min。本專利技術提供的這種低溫凍存器官的處理方法，在器官待冷凍前使用干細胞條件培養基灌注，提高了組織細胞的生存狀態，增加了抗凋亡能力，減少了細胞在離體后發生的氧化應激損傷；在復蘇后立即使用含鮮活間充質干細胞的完全培養基進行后灌注處理，對凍存過程中受到冷凍保護劑毒性和滲透損傷的細胞進行主動修復，可有效減少細胞凋亡比率，減少組織結構的破壞。附圖說明圖1.為本專利技術提供的器官深低溫凍存方法流程圖；圖2.腎動脈插管及結扎固定；圖3.各組標本HE染色結果；A為新鮮大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；B為新鮮大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；C為凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；D為凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；E為MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(40×)；F為MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片HE染色(200×)；圖4.各實驗組大鼠腎臟腎小管paller氏評分；圖5.各組標本TUNEL染色結果；A,B.新鮮大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)；C,D.凍存對照組大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)；E,F.MSC灌注組大鼠腎臟石蠟切片TUNEL染色(200×)。具體實施方式為明確本專利技術的目的、技術方案和優點，下面以大鼠腎臟為例，對本專利技術的技術方案進行清楚、完整的描述。實施例1大鼠腎臟的凍存及復蘇取培養至第4-6代的脂肪間充質干細胞，傳代后換新鮮培養基，48h后收集培養上清待用。選取8-12周齡SD大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉。打開腹腔，取其腎臟，注意保持腎動脈及靜脈結構完整。將取出腎臟置于4℃生理鹽水中沖洗，后置于同樣預冷的干細胞條件培養基。通過腎動脈插管并行絲線固定，結扎腎動脈分支后與預冷至4℃的程控降溫器官灌注儀相連，啟動定量進液泵，以1.5ml/min的速率向腎臟灌注干細胞條件培養基，時間60min（圖2）。灌注液換為冷凍保護劑，以同樣方式進行灌注。將灌注完畢的腎臟裝入冷凍袋，置于程序降溫儀中，程序設定為①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至-18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至-45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至-90℃，保持5min。隨后將凍存袋投入液氮。凍存一周后，將凍存腎臟取出，置于37℃水浴融化，時刻搖動使溫度分布均勻。將培養至第4-6代的脂肪間充質干細胞使用胰酶消化，使用預冷至4℃的條件培養基重懸調整細胞濃度為1×107/L。器官在水浴中完全融化后移入干細胞條件培養基，再次將腎動脈插管與灌注儀連接，使用步驟8所述干細胞懸液進行灌注，以1.5ml/min的速率進行30min。實施例2凍存器官復蘇后活性的測定在凍存實驗中將大鼠腎臟分為三組，分別為：新鮮組：取大鼠腎臟后立即固定于4%多聚甲醛，不經凍存。對照組：按照一般凍存方法不經干細胞處理凍存。實驗組：按照本專利技術所述方法進行凍存。在凍存一周后復蘇各組器官，對其結構的完整性和細胞活性進行測定。形態學分析組織石蠟切片的制作石蠟包埋及切片：將各組腎臟通過腎動脈沿冠狀面切開，將其中一半組織置于4%多聚甲醛中進行固定。另一半組織用于分子生物學檢測。固定組織經脫水、透明、浸蠟、包埋制作石蠟組織塊，在石蠟切片機上進行冠狀連續切片，厚度為4um。蘇木素-伊紅染色（HE染色）脫蠟水化：將石蠟切片60℃烤片30min后依次投入二甲苯20min×2，無水乙醇10min×2,95%乙醇5min×2,90%乙醇5min，80%乙醇5min，70%乙醇5min，PBS5min×3.染色分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種降低深低溫凍存組織器官冰晶損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)?將待冷凍的器官連接預冷至4℃的梯度濃度混合程控降溫器官灌注儀，灌注25℃恒溫的間充質干細胞條件培養基，灌注時間為30?60?min；所述間充質干細胞條件培養基為傳代5代內脂肪、臍帶、臍血或骨髓中的一種的間充質干細胞，在傳代后24h后長到70~80%匯合，更換無血清間充質干細胞培養基，48h后收集的培養上清，經1000~3000g離心10~30min，取上清后使用0.1μm~0.22μm微孔濾膜過濾后所得；2）然后向器官灌注預冷至4℃的冷凍保護劑，灌注時長30min；3）將處理完畢的器官放入冷凍袋，封口后置于程控降溫儀中，按照設定降溫程序進行程序化降溫，待其溫度降至?80℃后投入液氮中存放；所述程控降溫儀降溫程序設定為①4℃平衡，②以1℃/min的速度降至0℃，并保持10min，③以2℃/min的速度降至?18℃，保持15min，④以2℃/min速度降至?45℃，保持15min，⑤再以5℃/min的速度降至?90℃，保持5min；4）復蘇器官時，將凍存器官自液氮取出后置于37℃水浴中，不斷搖動；5）完全融化后再次進行灌注，灌注液為12?25℃的含間充質干細胞條件培養基，灌注時間為30min?60min；處理完成的器官可直接進行移植。...

【技術特征摘要】
1.一種降低深低溫凍存組織器官冰晶損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將待冷凍的器官連接預冷至4℃的梯度濃度混合程控降溫器官灌注儀，灌注25℃恒溫的間充質干細胞條件培養基，灌注時間為30-60min；所述間充質干細胞條件培養基為傳代5代內脂肪、臍帶、臍血或骨髓中的一種的間充質干細胞，在傳代后24h后長到70~80%匯合，更換無血清間充質干細胞培養基，48h后收集的培養上清，經1000~3000g離心10~30min，取上清后使用0.1μm~0.22μm微孔濾膜過濾后所得；2）然后向器官灌注預冷至4℃的冷凍保護劑，灌注時長30min；3）將處理完畢的器官放入冷凍袋，封口后置于程控降溫儀中，按照設定降溫程序進行程...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李安娜，李棟，
申請(專利權)人：濟南萬泉生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：山東,37