一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用技術

本發明專利技術涉及一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用。取獨活干粉，經無水乙醇室溫浸提，將提取液采用減壓蒸餾濃縮得棕色粗提物，乙醇粗提物經乙酸乙酯?水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相，減壓蒸餾獲得具有強殺松材線蟲活性的獨活乙酸乙酯提取物，利用柱層析、重結晶等分離方法從中分離得到蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯、花椒毒素等4種具有明顯殺松材線蟲活性的香豆素類化合物。獨活提取物在1mg/mL濃度下72小時后對松材線蟲的校正死亡率達95.27％。在本發明專利技術操作方法簡單，原料來源便捷，成本低廉，高效低毒，安全環保，獨活提取物在控制松材線蟲病方面具有開發潛力，可應用于殺松材線蟲的天然制劑。

Angelica extract preparation method and application thereof have the killing activity of pine wood nematode

The present invention relates to angelica extract preparation method and application thereof have the killing activity of pine wood nematode. Take angelica powder, after ethanol extraction at room temperature, the extract was concentrated by vacuum distillation to obtain Brown crude extracts, ethanol extracts of the three ethyl acetate water liquid extraction with ethyl acetate, and vacuum distillation to obtain the ethyl acetate extract of Angelica strong nematicide activity, using column chromatography and recrystallization separation methods such as isolated Osthol, two alcohol ester, hydrogen European mountain Qin Angelica bergapten, Xanthotoxin and other 4 kinds of coumarin compounds has obvious nematicide activity from. Lerivisiticum extract at the concentration of 1mg/mL 72 hours after the corrected mortality of Bursaphelenchus xylophilus reached 95.27%. The invention is simple in operation, the source of raw materials convenient, low cost, high efficiency and low toxicity, safety and environmental protection, has the potential of pubescent angelica root extract in controlling pine wilt disease, natural preparation can be used to kill pine wood nematode.

【技術實現步驟摘要】
一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用
：本專利技術涉及一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用，屬于林業病蟲害防治

技術介紹
：松材線蟲病，又稱松萎蔫病(Pinewiltdisease，PWD)，是一種極具毀滅性的松樹病害,松樹一經感染，蔓延迅速，涉及數十種松屬植物，世界多個國家存在疫情。我國內地于1982年在南京中山陵園風景區首次發現松材線蟲病，現已擴展至江蘇、安徽、浙江、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、云南、陜西等16個地區，蔓延迅速，發生面積不斷擴大，危害程度不斷加重，對我國的松樹資源、自然景觀和生態環境構成了嚴重威脅。松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)是松材線蟲病主要的病原，松材線蟲的防控對于控制松材線蟲病至關重要。目前防控松材線蟲最直接、有效的殺線蟲劑主要是廣譜性合成藥劑，線蟲易產生耐藥性，且存在高毒、高殘留、污染環境、對非靶標有益生物構成威脅等缺陷，這使得生態友好的天然殺線劑的開發顯得尤為迫切。自然界植物資源豐富，植物源殺線劑近些年一直是松材線蟲病研究的熱點。獨活是傘形科植物重齒毛當歸(AngelicapubescensMaxim.f.biserrataShanetYuan)的干燥根，是我國的傳統中草藥，湖北、四川、陜西為主要栽培地，現有多處有大規模種植基地，來源豐富。獨活可用于風寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風頭痛、四肢麻痹等病癥的治療，我們在對獨活生物活性成分的研究過程中發現，一種提取物具有很強殺的松材線蟲活性。國內外還未見有關于獨活提取物對松材線蟲有殺滅活性的報道。本專利技術首次公布了獨活提取物在殺滅松材線蟲中的應用，以期為新型天然植物源松材線蟲防治藥物的開發奠定一定的基礎。
技術實現思路
：本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法及其應用。獨活提取物具有強烈的殺松材線蟲的活性，安全低毒，提取方法簡單，成本低廉，其中的主要殺松材線蟲活性成分確定，可為仿生合成獲得更高活性的天然衍生物提供化學結構模型。為了實現上述專利技術目的，本專利技術以粉碎的獨活干粉為原料，經溶劑浸提、減壓濃縮、有機溶劑萃取等方法得到一種獨活的提取物，在1mg/mL濃度下能有效殺滅松材線蟲。本專利技術方法按照如下步驟操作：第一步，取干燥的獨活于植物粉碎機中粉碎得獨活干粉，加入無水乙醇室溫下超聲波震蕩輔助避光浸提48小時，其中，獨活干粉與乙醇料液比為50:1(g/L)，然后真空過濾去渣，得乙醇提取液，重復提取一次，合并提取液；第二步，提取液采用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮得棕色乙醇粗提物；第三步，乙醇粗提物經體積比為1：1的乙酸乙酯-水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相；第四步，減壓蒸餾，獲得具有強殺松材線蟲活性的獨活提取物。取以上所得獨活提取物適量，采用5％的二甲基亞砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)溶解，配制成濃度為1mg/mL的溶液，取50μL，加入到24孔板相應的孔中，再加入50μL線蟲懸浮液，混勻，以5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)為對照，置于26℃培養箱中避光培養，分別于24小時,48小時,72小時后取出，在體式顯微鏡下觀察線蟲存亡情況(線蟲僵直并以解剖針觸動無反應確定為死亡狀態)，根據如下公式計算各處理線蟲的校正死亡率：結果表明這種獨活提取物在1mg/mL濃度下72小時后對松材線蟲的校正死亡率達95.27％。以上得到的具有殺松材線蟲活性的獨活提取物進行硅膠柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫(石油醚：乙酸乙酯體積比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯)，洗脫組分經硅膠薄層層析(GF254)檢測，合并相同組分，得到10個組分：Fr.1-Fr.10，經殺線活性測試確定F5和F6為高活性組分(1mg/mL，72小時校正死亡率>50％)；對兩組分進一步分離純化，F5組分再進行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)洗脫，得到兩個組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯；F6組分經再次硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)洗脫，得到兩組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結晶得香豆素類化合物佛手柑內酯和花椒毒素。蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、佛手柑內酯、花椒毒素這4種香豆素類化合物，化學結構式分別為：蛇床子素的特征常數為：無色到白色針狀晶體(石油醚-乙酸乙酯)，EIMS(m/z):244[M·]+,1HNMR(500MHz,CDCl3):δ6.26(1H，d，H-3)，7.63(1H，d，H-4)，7.29(1H，t，H-5)，6.85(1H，d，H-6)，3.94(3H，s，OCH3)，5.24(1H，m，H-2，)，3.56(2H，d，H-1’),1.84(3H，s，H-4’)，1.67(3H，s，H-5’)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ160.30(C-2)，113.08(C-3)，143.68(C-4)，126.18(C-5)，107.40(C-6)，161.32(C-7)，107.40(C-8)，152.93(C-9)，118.14(C-10)，21.97(C-1’)，121.1(C-2’)，132.64(C-3’)，25.76(C-4’)，17.93(C-5’)，56.08(OCH3)。二氫歐山芹醇當歸酸酯的特征常數為：白色晶體(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):328[M·]+；1HNMR(500MHz,CDCl3):δ6.23(1H，d,H-3)，7.65(1H，d，H-4)，7.28(1H，d，H-5)，6.76(1H，d，H-6)，5.14(1H，dd，H-2’)，3.40(2H，t，H-3’)，1.66(3H，s，H-5’)，1.60(3H，s，H-6’)，5.99(1H，dd,H-8’)，1.69(3H，s，H-10’),1.90(3H，dd,H-11)；13CNMR(125MHz,CDCl3):δ161.00(C-2)，112.23(C-3)，143.95(C-4)，128.82(C-5)，106.66(C-6)，164.05(C-7)，112.23(C-8)，151.34(C-9)，113.57(C-10)，89.30(C-2’)，27.67(C-3’)，82.07(C-4’)，21.25(C-5’)，22.36(C-6’)，167.12(C-7’)，128.74(C-8’)，137.53(C-9’)，15.59(C-10’)，20.5(C-11’)。佛手柑內酯的特征常數為：白色微針狀晶體(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):216[M·]+,1HNMR(500MHz,CDCl3):δ4.27(3H,s,OCH3),6.27(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),7.03(1H,d,J＝2.4Hz,H-3’),7.13(1H,s,H-8),7.60(1H,d,J＝2.4Hz,H-2’),8.15(1H,d,J＝9.8Hz,H-4).13CNMR(125M本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法，其特征在于按照如下步驟操作：第一步，取干燥的獨活于植物粉碎機中粉碎得獨活干粉，加入無水乙醇室溫下超聲波震蕩輔助避光浸提48小時，其中，獨活干粉與乙醇料液比為50g:1L，然后真空過濾去渣，得乙醇提取液，重復提取一次，合并提取液；第二步，提取液采用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮得棕色乙醇粗提物；第三步，乙醇粗提物經體積比為1：1的乙酸乙酯?水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相；第四步，減壓蒸餾，獲得具有強殺松材線蟲活性的獨活提取物；所述獨活提取物進行硅膠柱層析分離，采用石油醚?乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫，石油醚：乙酸乙酯體積比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯，洗脫組分經硅膠薄層層析GF

【技術特征摘要】
1.一種具有殺滅松材線蟲活性的獨活提取物制備方法，其特征在于按照如下步驟操作：第一步，取干燥的獨活于植物粉碎機中粉碎得獨活干粉，加入無水乙醇室溫下超聲波震蕩輔助避光浸提48小時，其中，獨活干粉與乙醇料液比為50g:1L，然后真空過濾去渣，得乙醇提取液，重復提取一次，合并提取液；第二步，提取液采用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮得棕色乙醇粗提物；第三步，乙醇粗提物經體積比為1：1的乙酸乙酯-水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相；第四步，減壓蒸餾，獲得具有強殺松材線蟲活性的獨活提取物；所述獨活提取物進行硅膠柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫，石油醚：乙酸乙酯體積比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯，洗脫組分經硅膠薄層層析GF254檢測，合并相同組分，得到10個組分：Fr.1-Fr.10，經殺線活性測試確定F5和F6為高活性組分，1mg/mL濃度下在72小時校正死亡率>50％；對兩組分進一步分離純化，F5組分再進行硅膠柱層析，以體積比為8：1的石油醚-乙酸乙酯洗脫，得到兩個組分，分別于石油醚-乙酸乙酯中重結...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭群群，李榮貴，杜桂彩，梁晨燕，李詠幸，張明學，
申請(專利權)人：青島大學，
類型：發明
國別省市：山東,37