本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種合成的生物活性分子，用于將一種活性成分固定到多瘤病毒的病毒蛋白１（ＶＰ１）。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)，衍生自多瘤病毒的病毒蛋白２（ＶＰ２）或３（ＶＰ３）的氨基酸序列Ａ１被結(jié)合至活性成分的一個末端。（*該技術(shù)在2020年保護過期，可自由使用*）
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及合成的生物活性分子及其制備方法。Chen，X.S.，Stehle，T.和Harrison，S.C.(1998)多瘤病毒內(nèi)部蛋白VP2與主要衣殼蛋白VP1的相互作用和VP2參與病毒進入的含義，EMBO J.Vol.17，No.12，pp3233-3240描述了負責(zé)錨定多瘤病毒的病毒蛋白VP2和VP3至病毒蛋白1的相互作用。根據(jù)該文獻，錨定發(fā)生在VP2或VP3的C末端區(qū)。US4,950,599公開了多瘤病毒適合將活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運進細胞中。此外，DE 196 18 797 A1公開了來自多瘤病毒的殼粒適合將分子材料轉(zhuǎn)運進細胞。EP 0 259 149 A2公開了使用輪狀病毒內(nèi)部衣殼蛋白VP6作為免疫載體分子和疫苗，以刺激針對輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答。為此，免疫原性肽通過肽-肽相互作用與VP6結(jié)合，該相互作用的細節(jié)未披露。VP6在此并不形成結(jié)構(gòu)殼粒，相反顯示獨特的結(jié)構(gòu)多態(tài)性。VP6以單體或寡聚體形式存在。盡管寡聚體VP6可以形成顆粒，但這些顆粒不是衣殼或殼粒，而是非結(jié)構(gòu)載體蛋白。Redmond，M.J.等(1991)輪狀病毒顆粒作為免疫載體，傳遞來自感染物質(zhì)和內(nèi)源蛋白的肽，Mol.Immuno.28,269-278介紹了使用輪狀病毒內(nèi)部衣殼蛋白VP6作為轉(zhuǎn)運顆粒。為此，VP6通過來自于輪狀病毒蛋白VP4的肽序列的結(jié)合蛋白與免疫原性肽或蛋白結(jié)合。與來自VP4的肽序列偶聯(lián)的抗原定位于轉(zhuǎn)運顆粒之外，因此不能受到保護免于降解。GB 22 57 431 A描述了來自噬菌體MS-2膜蛋白的嵌合蛋白的用途。改蛋白可以形成衣殼。抗原肽或偶聯(lián)于其上的肽與衣殼外部結(jié)合。在大腸桿菌中表達時嵌合蛋白的自發(fā)組裝導(dǎo)致被細菌DNA或蛋白污染的高風(fēng)險。DE 43 35 025 A1公開了一種內(nèi)體溶解活性病毒樣顆粒，其已用膜活性肽在其外表面上修飾過。所述顆粒的制備復(fù)雜。本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。具體說，本專利技術(shù)意在方便地提供一種與多瘤病毒VP1特異性結(jié)合的活性物質(zhì)。該目的通過權(quán)利要求1、9和19的特征達到。合適的實施方案可由權(quán)利要求2到8、10到18和20到24的特征產(chǎn)生。本說明書使用以下定義衍生氨基酸序列與其來源氨基酸序列相比沒有改變或有氨基酸交換、插入或缺失的氨基酸序列。C末端在C末端的區(qū)域。合成分子人工制備分子。偶聯(lián)或附著共價或非共價結(jié)合。非共價結(jié)合可以通過例如螯合結(jié)合實現(xiàn)。遺傳工程包括將限定核酸導(dǎo)入細胞中的方法的技術(shù)。本專利技術(shù)提供一種合成的生物活性分子，其中衍生自多瘤病毒病毒蛋白2(VP2)或3(VP3)C末端的氨基酸序列與活性物質(zhì)連接。設(shè)想的合成生物活性分子使其可以以簡單方式將活性物質(zhì)與多瘤病毒VP1特異性締合。這導(dǎo)致結(jié)構(gòu)殼粒的形成。使用該殼粒可以以簡單方式制備作為活性物質(zhì)通用載體的衣殼。有利地是，氨基酸序列(A1)包括10到55，優(yōu)選28到38個氨基酸。限定到相對較短的氨基酸序列降低了制備合成生物活性分子的費用并簡化了其制備過程。有利地是，該氨基酸序列至少在某些區(qū)段相應(yīng)于以下VP2序列氨基酸250到319，優(yōu)選氨基酸260到300，特別優(yōu)選氨基酸287到297。所述氨基酸序列確保了對VP1的錨定。在合成生物活性分子中，優(yōu)選氨基酸序列(A1)具有以下序列Trp Met Leu Pro Leu Ile Leu Gly Leu Tyr Gly15 10優(yōu)選活性物質(zhì)與氨基酸序列(A1)通過接頭結(jié)合。該接頭可以由至少一個氨基酸，一種肽、蛋白、脂質(zhì)等組成。活性物質(zhì)可以選自以下核酸、寡核苷酸、蛋白、肽、肽類物質(zhì)、PNA、所述物質(zhì)的修飾形式和低分子量藥物活性物質(zhì)。特別合適的是通過以下所述反應(yīng)基團之一與氨基酸序列偶聯(lián)的活性物質(zhì)。合成生物活性分子可以是偶聯(lián)于多瘤病毒VP1衍生氨基酸序列和/或是一種藥物的成分。本專利技術(shù)另一方面提供一種制備本專利技術(shù)的合成生物活性分子的方法，該方法具有以下步驟a)提供衍生自多瘤病毒病毒蛋白2(VP2)或3(VP3)C末端的氨基酸序列(A1)，該氨基酸序列(A1)具有偶聯(lián)劑，并且b)將活性物質(zhì)與氨基酸序列(A1)通過偶聯(lián)劑結(jié)合。偶聯(lián)劑可以具有氨基酸甘氨酸、半胱氨酸或通過賴氨酸結(jié)合的甘氨酸。偶聯(lián)劑優(yōu)選是與氨基酸序列(A1)N或C末端結(jié)合的另一種合成氨基酸序列(A2)。合成生物活性分子可以至少部分通過遺傳工程制備。為此，氨基酸序列(A1)、另一種氨基酸序列(A2)和活性物質(zhì)可以完全或部分通過遺傳工程制備。另一種氨基酸序列(A2)具有甘氨酸和/或具有功能側(cè)鏈基團的氨基酸較為便利，功能側(cè)鏈基團可以選自氨基、巰基、羧基、羥基、胍、苯基、吲哚和咪唑基。偶聯(lián)劑可以是通過氨基酸優(yōu)選甘氨酸與氨基酸序列(A1)C或N末端結(jié)合的反應(yīng)基團。可以是下列成分之一具有單溴乙酰基的氨基酸，具有單氯乙酰基的氨基酸，具有3-硝基-2-吡啶次磺基(pyridinesulfenyl)(Npys)的氨基酸。設(shè)想的反應(yīng)活性基團可以通用。它們適于偶聯(lián)多個活性物質(zhì)。已經(jīng)證實，通過硫醚或二硫鍵將活性物質(zhì)結(jié)合到氨基酸序列(A1)或另一種氨基酸序列(A2)特別有利。實踐中，這類鍵可以方便地制備。當然，使用其他反應(yīng)活性基團也是可行的。合適的基團包括N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯(succinimidyl bromoacetate)或N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP)。活性物質(zhì)可以通過接頭與氨基酸序列(A1)或另一種氨基酸序列(A2)結(jié)合。接頭可以由至少一個氨基酸、一種肽、蛋白、脂質(zhì)等組成。本專利技術(shù)還提供一種制備本專利技術(shù)的合成生物活性分子的方法，該方法具有以下步驟aa)合成衍生自多瘤病毒病毒蛋白2(VP2)或3(VP3)C末端的氨基酸序列(A1)，和bb)合成活性物質(zhì)即一種肽并偶聯(lián)至氨基酸序列(A1)，其中步驟aa和bb通過肽合成或遺傳工程方法進行。在步驟bb)中，氨基酸序列(A1)通過活性物質(zhì)延伸。活性物質(zhì)的延長和附著通過重復(fù)附著氨基酸殘基進行。該方法可以特別方便地進行。上述兩種方法的其他優(yōu)選實施方案可參見下文。實施例A.肽的合成和純化通過同時多個肽合成在肽合成儀(PSSM-8型，SHIMADZU，Japan)上合成肽(Schnorrenberg，G.和Gerhardt，H.(1989)Tetrahedron 45，7759)，使用Shepppard的9-芴甲氧羰基(Fmoc)/tert.丁基(But)策略(Atherton，E.和Sheppard，R.C.(1989)《固相肽合成實用方法》IRLPress，Oxford)。偶聯(lián)反應(yīng)使用6當量Fmoc保護的氨基酸/1-羥基苯并三唑(HOBt)/12當量正甲基嗎啉，在聚合物載體樹脂(Tentagel S Trityl樹脂，RAPP聚合物，Tubingen，Germany)上使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)，裝載量為2mmol/克樹脂。肽含有C末端COOH基團。在合成中使用以下保護基團Cys(Trt)，Arg(Pbf)，Ser(But)，Thr(But)，Asp(OBut)，Glu(OBut)，Asn(Trt)，Gln(Trt)，Lys(Boc)，His(Trt)，Trp(Boc)，其中Trt為三苯甲基，But為叔丁基，OBut為叔丁基酯，Bo本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種合成的生物活性分子，其中衍生自多瘤病毒病毒蛋白２（ＶＰ２）或３（ＶＰ３）Ｃ末端的氨基酸序列（Ａ１）與一種活性物質(zhì)連接。
【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：W貝特林，C雷澤爾，J瓦爾特，
申請(專利權(quán))人：諾凡貝爾分子醫(yī)學(xué)股份公司，
類型：發(fā)明
國別省市：DE[德國]
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