硝基還原酶的特異性熒光探針及其制備和用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤缺氧程度的應用制造技術

本發明專利技術提供了硝基還原酶的特異性熒光探針及其制備和將其應用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤缺氧程度的試劑，由腫瘤生物標記物識別基團(sensor)、腫瘤靶向基團(target)、熒光基團(dye)通過化學鍵連接而成。該試劑基于腫瘤的缺氧性和硝基還原酶在缺氧腫瘤中的高表達，可在具有缺氧微環境，并高表達硝基還原酶的腫瘤中應用，結合熒光成像儀，可用于腫瘤靶向熒光成像，腫瘤缺氧程度監測和監測腫瘤轉移等應用。該試劑在應用中實現了高靈敏度，高特異性，為醫學上研究腫瘤和臨床上監測、治療腫瘤轉移提供了有效的工具，因此在腫瘤靶向熒光成像，腫瘤缺氧程度監測和監測腫瘤轉移等具有良好的應用前景。

Specific fluorescent probe of nitro reductase and its preparation and application in tumor targeted fluorescence imaging and monitoring tumor hypoxia

The present invention provides nitroreductase specific fluorescent probe and its preparation and its application in tumor targeting fluorescence imaging and monitoring tumor hypoxia, by tumor biomarkers identification group (sensor), tumor targeting group (target), fluorophore (dye) connected by chemical bond. The reagent of tumor hypoxia and hypoxia in tumor based on nitro reductase in high expression in hypoxia microenvironment, and high expression of nitroreductase tumor, combined with fluorescence imaging, can be used for tumor targeted fluorescence imaging, tumor hypoxia monitoring and monitoring applications such as tumor metastasis. The reagent to achieve high sensitivity in the application, high specificity, for medical research and clinical tumor monitoring, provides an effective tool for tumor metastasis, therefore in tumor targeted fluorescence imaging, it has a good application prospect in tumor hypoxia monitoring and monitoring of tumor metastasis.

【技術實現步驟摘要】
硝基還原酶的特異性熒光探針及其制備和用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤缺氧程度的應用
本專利技術屬于生物醫學
，涉及一類檢測試劑及其制備方法和應用，具體為硝基還原酶的特異性熒光探針及其制備方法和用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤缺氧程度的應用。
技術介紹
細胞的生長和增殖有賴于充分的氧氣和能量供應，在供氧量正常的組織中，細胞的能量來源約90％依賴于線粒體的有氧氧化。然而，腫瘤組織內，腫瘤細胞失控性生長和增殖消耗大量的營養和氧氣，其內部不能及時、有效的建立新生血管網，或新生血管網的結構和功能異常，存在暫時性封閉或“盲端”；并且通透性較高，液體外滲至組織間隙導致血流黏滯阻力增加。這些因素使腫瘤內部血流減少，氧的供應遠少于氧的需求，腫瘤細胞處于缺氧狀態。此外，惡性腫瘤的自身進程以及抗腫瘤治療所造成的貧血亦加劇了腫瘤的缺氧，腫瘤內部缺氧微環境由此產生。硝基還原酶家族屬黃素酶，可以在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代謝芳香族硝基化合物或者硝基取代的雜環化合物。研究表明缺氧組織或細胞以及腫瘤中硝基還原酶的含量相對正常狀態呈現升高趨勢。在缺氧條件下以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH作為電子供體細胞內的硝基還原酶可催化多種外源硝基芳香族化合物發生單電子轉移，生成硝基陰離子自由基，隨后進一步被還原成羥胺或氨基。研究發現，硝基還原酶通常存在于細菌中，如大腸桿菌，在人的正常細胞中幾乎不存在，而在惡性腫瘤中大量存在。因此，硝基還原酶可以作為腫瘤的生物標記物。小分子熒光探針被廣泛的應用于化學分析，生物分析以及生物動態過程實時、非侵入性監測。因此，小分子熒光探針被廣泛用于藥物篩選和治療效果的評估，實現了腫瘤治療效果的早期監測。RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)氨基酸序列是多種生物細胞外基質和血漿蛋白結構中常見的基本成分，也是纖維細胞黏附的主要位點。人的基因組可產生24個不同的已知的整合素，大約有1/3的整合素在不同程度上識別RGD序列。腫瘤新生血管內皮細胞膜表面表達高水平的αvβ3/α5β1和α5β1整合素，因此含有RGD序列的蛋白，作為整合素配體，能夠靶向性到達腫瘤局部新生血管內皮。外源性RGD多肽及其類似物可與體內含RGD序列的物質競爭結合，從而阻斷血管上皮細胞增殖的信使傳遞，終止細胞增殖，使血管不能生長，導致腫瘤組織供氧系統中斷，最終細胞萎縮、凋亡。研究發現RGD環狀多肽比線狀多肽有更高的受體結合特異性。基于上述原因，大量含RGD序列的線性或環狀多肽被作為αvβ3拮抗劑合成，部分已成功制成熒光探針。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術的目的在于制備了一類硝基還原酶的特異性熒光探針及制備方法和應用。該探針本體和被硝基還原酶還原后的產物，熒光強度具有明顯的差別，且產物熒光可由熒光檢測器檢測，利用該探針反應可對多種生物體系中硝基還原酶的分布和反應效率進行評價。本專利技術第二個目的提供一種腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑。本專利技術第三個目的提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用。本專利技術第四個目的提供提供一種監測腫瘤缺氧程度的試劑。本專利技術第五個目的提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于監測腫瘤缺氧程度的試劑上的應用。本專利技術的技術方案如下：硝基還原酶的特異性熒光探針，該探針由檢測基團sensor、熒光基團dye、腫瘤靶向基團target通過化學鍵連接而成；其結構為：結構I型sensor-dye或結構II型sensor-dye-target。進一步，所述檢測基團sensor結構為：所述熒光基團dye可以為熒光素類似物，其結構為：所述腫瘤靶向基團target的結構為：本專利技術所述硝基還原酶的特異性熒光探針，優選，所述結構I型sensor-dye的結構為下式FBN-1或FBN-2所示：所述結構II型sensor-dye-target的結構為下式FBN-3或FBN-4所示：本專利技術所述硝基還原酶的特異性熒光探針，本身沒有熒光，探針中的硝基被硝基還原酶特異性還原，還原后的熒光產物具有很高的熒光量子產率，可采用熒光檢測器實現底物熒光變化的快速、靈敏檢測。本專利技術所述硝基還原酶的特異性熒光探針，作為硝基還原酶的特異性底物，通過定量檢測單位時間內的底物消除率或其產物的生成率來定量測定不同生物體系中硝基還原酶的活性。本專利技術還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針的制備方法，該方法為：a)通過在堿性條件下用對硝基芐溴將熒光素(化合物(1))羥基烷基化制備得到硝基還原酶的特異性熒光探針FBN-1；b)通過還原FBN-1的酮羰基得到羥基后，再用對硝基芐溴將其烷基化得到硝基還原酶的特異性熒光探針FBN-2。c)FBN-3和FBN-4分別由FBN-1,FBN-2和RGD環肽縮合而成。本專利技術還提供一種腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑，所述試劑含有上述硝基還原酶的特異性熒光探針。本專利技術還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用。本專利技術還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于腫瘤靶向熒光成像和監測腫瘤轉移的試劑上的應用，可作為手術導航的試劑。本專利技術還提供一種監測腫瘤缺氧程度的試劑，所述試劑含有上述硝基還原酶的特異性熒光探針。本專利技術還提供所述硝基還原酶的特異性熒光探針在制備用于監測腫瘤缺氧程度的試劑上的應用。專利技術詳述該探針由檢測團和熒光基團通過化學鍵連接而成，概述為結構I型，其可表示為sensor-dye。硝基還原酶的特異性熒光探針具體實例為：結構I型：dye-sensorI型探針作為硝基還原酶的特異性底物，本身由于硝基的強吸電子效應，導致d-PET效應而猝滅分子熒光，當其被硝基還原酶還原后，釋放出化合物(1)，熒光強度大大增強。通過定量檢測單位時間內還原產物的生成量來測定酶或細胞制備液等生物樣品及細胞中硝基還原酶的活性。識別機理如下：1)在PBS或Tris-HCl等常用緩沖液中，反應溫度為20℃至45℃之間，優選37℃為最優反應時間；孵育體系pH介于5.0～8.5之間，優選pH7.4為最優反應pH值；反應時間為5～30分鐘，優選反應時間為20min。2)通過測定單位時間熒光強度的增加倍數評價硝基還原酶的活性，可采用熒光檢測器實現產物及底物的快速靈敏檢測；熒光檢測條件為：激發波長490nm，在510～550nm進行熒光發射譜的檢測。本專利技術中的硝基還原酶的熒光探針具有以下特點：該特異性探針底物在生物體中僅和硝基還原酶發生還原反應，其他常見的生物體系基質及雜質例如：無機鹽、糖類、氨基酸、維生素、生物巰基物種、氧化物種不產生干擾。該探針的相對熒光量子效率達到熒光量子產率較高，且激發波長為490nm，該波長較常見，可用熒光光譜法檢測，測定限可達0.65ng/mL。該探針對生物體的毒性較低，可用于動物生物體中和細菌生長過程中產生硝基還原酶含量的檢測。本專利技術的又一目的，提供了一種手術導航的試劑和方法。該試劑可以由I型試劑連接腫瘤靶向基團(target)制備而成，可實時靶向熒光成像腫瘤細胞或組織，該試劑可概述為結構II型，其可表示為sensor-dye-target。實時靶向熒光成像腫瘤細胞或組織的試劑具體實例為：結構II型：target-dye-se本文檔來自技高網...

【技術保護點】
硝基還原酶的特異性熒光探針，其特征在于，該探針由檢測基團sensor、熒光基團dye、腫瘤靶向基團target通過化學鍵連接而成；其結構為：結構I型sensor?dye或結構II型sensor?dye?target。

【技術特征摘要】
1.硝基還原酶的特異性熒光探針，其特征在于，該探針由檢測基團sensor、熒光基團dye、腫瘤靶向基團target通過化學鍵連接而成；其結構為：結構I型sensor-dye或結構II型sensor-dye-target。2.根據權利要求1所述硝基還原酶的特異性熒光探針，其特征在于，所述檢測基團sensor結構為：所述熒光基團dye可以為熒光素類似物，其結構為：所述腫瘤靶向基團target的結構為：3.根據權利要求1所述硝基還原酶的特異性熒光探針，其特征在于，所述結構I型sensor-dye的結構為下式FBN-1或FBN-2所示：所述結構II型sensor-dye-target的結構為下式FBN-3或FBN-4所示：4.根據權利要求1-3任一項所述硝基還原酶的特異性熒光探針，其特征在于，所述探針本身沒有熒光，探針中的硝基被硝基還原酶特異性還原，還原后的熒光產物具有很高的熒光量子產率，可采用熒光檢測器實現底物熒光變化的快速、靈敏檢測。5.根據權利要求1-3任一項...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳君臣，羅深圳，姚德帆，李尚，張文旭，賴燕華，朱曉敏，田禾，
申請(專利權)人：華東理工大學，
類型：發明
國別省市：上海,31