耐逆性相關轉錄因子蛋白NAC及其應用制造技術

耐逆性相關轉錄因子蛋白NAC及其應用，氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明專利技術從耐極端干旱植物沙冬青中克隆獲得一個轉錄調控因子NAC蛋白，構建植物表達載體，通過農桿菌介導轉化法將其導入擬南芥中，經過潮霉素初步篩選、分子檢測、干旱脅迫、體內鐵含量測定等手段，得到了抗旱能力和吸鐵能力都有顯著提高的轉基因擬南芥株系。獲得能高效吸收鐵，并且抗干旱的轉基因植物新品種，對于提高作物的品質，增強植物對逆境脅迫的耐受能力，具有重要意義。

Stress resistance related transcription factor protein NAC and uses thereof

Resistance related transcription factor protein NAC and its application, the amino acid sequence is shown as SEQ ID No.1. The present invention cloned a transcription factor NAC protein from extreme drought resistant plant Ammopiptanthusmongolicus, construct plant expression vector by Agrobacterium mediated transformation into Arabidopsis thaliana, after hygromycin screening, molecular detection, drought stress, iron content determination method, the drought resistance of transgenic Arabidopsis thaliana ability and iron absorption ability has been significantly improved strains. Obtaining new varieties of transgenic plants that can absorb iron efficiently and drought resistant is of great significance for improving crop quality and enhancing plant tolerance to stress.

【技術實現步驟摘要】
耐逆性相關轉錄因子蛋白NAC及其應用
本專利技術屬于植物基因工程領域，具體地說，是耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC及其在培育耐土壤干旱和高效吸鐵植物中的應用。
技術介紹
植物通過長期的進化，形成了一系列完善的逆境脅迫應答機制，包括細胞水平的耐受和植株整體水平的調控。在調控過程中，轉錄調控尤為重要。植物對逆境脅迫的耐受性，養分元素吸收能力的強弱，往往不是取決于某一單一因子，其性狀受到許多基因的影響。NAC轉錄因子是一類植物特有的轉錄因子，其生物學功能多樣化，參與調控多個生命現象，如種子發育，側根發育，植物細胞次生壁的生長，莖頂端分生組織的形成，以及參與生物和非生物脅迫反應。研究發現，NAC轉錄因子直接參與或通過調控參與干旱、高鹽、冷害應答基因的表達，在植物抗旱、耐鹽等非生物脅迫中起到重要作用。通過增強轉錄因子NAC蛋白的作用來促進這些抗逆基因資源發揮作用，使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。在提高作物對環境脅迫的分子育種中，與導入或改良個別基因功能來提高某種抗性的傳統方法相比，從改良或增強一個關鍵的轉錄因子NAC蛋白的調控能了著手，提高植物的抗逆性將是一種更為有效的方法和途徑。鐵是生物體生命活動中必需的微量元素之一，其參與生物體內呼吸作用、光合作用、DNA合成、氮素同化和固定、激素合成以及活性氧的形成與消除等重要的生理代謝過程。然而，在有氧土壤環境中，鐵的溶解性很低，植物可以利用的生物有效鐵很少，植物的嚴重缺鐵尤其是植物可食用部分低鐵含量是動物和人類缺鐵的主要根源。從長遠的經濟和社會效益考慮，通過生物學手段提高植物鐵的吸收、利用效率，培育富含生物活性鐵的作物籽粒，在改善人類鐵營養缺乏方面具有較大的優勢和潛力。因此，利用基因改造技術提高和促進植物對環境中鐵的吸收、體內運輸以及向籽粒轉移的措施和技術手段成為農業科學研究的重要的研究課題。
技術實現思路
解決的技術問題：本專利技術提供一種耐逆性相關轉錄因子蛋白NAC及其應用，該耐逆性相關轉錄因子蛋白可提高植物耐土壤干旱和高效吸鐵的能力。技術方案：耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC基因開放閱讀框，序列如SEQIDNo.2所示。含上述耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC基因的真核表達載體。上述的真核表達載體，所述載體是將所述植物耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC編碼基因與pGreen同源重組后得到的重組質粒。上述耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC在提高植物耐干旱及鐵吸收的應用。上述植物為雙子葉植物。上述雙子葉植物可為擬南芥和沙冬青。提高植物對鐵的吸收和提高植物耐干旱的方法，該方法包括將所述植物耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC編碼基因通過pGreen-AmNAC導入所述目的植物中。有益效果：目前的研究雖然獲得了很多植物逆境脅迫相關基因，但是，很少有報道這些基因同時能夠提高轉基因作物的吸鐵和耐干旱的能力。所以，需要深入研究現有基因的耐性機制，挖掘耐逆基因的新功能。本專利技術從耐極端干旱植物沙冬青中克隆獲得一個轉錄調控因子NAC蛋白，構建植物表達載體，通過農桿菌介導轉化法將其導入擬南芥中，經過潮霉素初步篩選、分子檢測、干旱脅迫、體內鐵含量測定等手段，得到了抗旱能力和吸鐵能力都有顯著提高的轉基因擬南芥株系。獲得能高效吸收鐵，并且抗干旱的轉基因植物新品種，對于提高作物的品質，增強植物對逆境脅迫的耐受能力，具有重要意義。附圖說明圖1為pGreen載體上的AmNAC基因構建示意圖；圖2為含目的條帶的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中出現約1008bp的AmNAC基因條帶，以野生型擬南芥的總DNA為負對照進行PCR反應，未出現1008bp的AmNAC基因條帶；圖3為經改造的擬南芥耐旱能力的測定結果圖。圖4為經改造的擬南芥體內鐵含量測定結果圖。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本專利技術，本專利技術的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是，應理解所述實施例僅是范例性的，不對本專利技術的保護范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神下，可以對技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本專利技術的保護范圍。實施例1：沙冬青轉錄因子NAC基因克隆和植物表達載體構建根據實驗室前期對沙冬青轉錄組測序的結果，在沙冬青轉錄組數據庫中挑選AmNAC基因，設計Gateway同源重組特異引物PCR產物為1005bp。上游引物F1：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGAGTTGCAGAGAAAGA-3'，下游引物R1：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTGCCTAAACCCAAACC-3'。提取水培生長30天的沙冬青的總RNA并以其為模板，以Oligo(dT)18為引物反轉錄，得到反轉錄產物cDNA。以此cDNA為模板，以特異引物F1和R1進行PCR擴增。然后用pDnor222.1載體進行Gateway克隆。PCR產物回收得到的AmNAC基因片段，在BP酶催化下與pDnor222.1載體連接，25℃連接過夜。用連接混合物轉化E.coliDH5α感受態細胞，挑選轉化平板上的菌落。提取白色菌落的質粒，用引物F1和R1進行PCR，得到約1008bp的AmNAC基因片段。從測序正確的陽性克隆中提取質粒，完成pGreen載體上的AmNAC基因構建（AmNAC-pGreen，T-DNA區示意圖見圖1）。用常規方法轉化農桿菌GV3101+pSoup，獲得工程農桿菌GV3101+pSoup：：AmNAC-pGreen，用于植物轉化。實施例2：轉基因擬南芥的制備用GV3101+psoup：：AmNAC-pGreen轉化擬南芥的步驟如下：（1）農桿菌的培養：從平板上挑取帶有AmNAC目的基因的農桿菌GV3101+pSoup陽性菌落，接種于含25mg/L利福平、50mg/L四環素和50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，28℃，200rpm振蕩培養OD600nm=1.0，用LB液體培養基稀釋菌液10倍，繼續震蕩培養4h；將菌液倒入無菌螺口帶蓋離心管內，蓋上管蓋，4000rpm離心10min；棄去上清，倒置離心管1min，流盡殘余液體；收集菌體。（2）農桿菌介導擬南芥轉化：在擬南芥初次開花時將花蕾減掉，促進側枝更多的花蕾增生。在用花序侵染法轉擬南芥之前，先用剪刀剪去已長成的角果，從而增加轉基因的陽性率，適合轉化的植株花卉并沒有成熟，也沒有產生已受精的莢果；用含有10%蔗糖的1/10MS溶液懸浮農桿菌，稀釋至OD600nm=0.8，懸浮液中加入終濃度為0.02%的SliwetL-77表面活性劑；將懸浮的菌液導入培養皿中，將擬南芥的花序浸入菌液（1min），浸染后的擬南芥植株橫臥于培養箱中，黑暗培養24h；將暗培養24h后的擬南芥置于正常光照培養條件下直立培養，保持充足的水分，3天后再侵染一次；待種子成熟后，收集T1代種子。（3）轉基因擬南芥的PCR檢測及純系的獲得：將T1代擬南芥種子播種在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養基平板上，挑取存活的擬南芥的一片葉片，提取總DNA，以總DNA為模板，用引物：上游引物F2：ATGGGAGTTGCAGAGAAAG，下游引物R2：TCATT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC，其特征在于氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

【技術特征摘要】
1.耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.編碼權利要求1所述耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC的基因，其特征在于核酸序列如SEQIDNo.2所示。3.含權利要求2所述耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC基因的真核表達載體。4.根據權利要求3所述的真核表達載體，其特征在于所述載體是將所述植物耐逆性相關的轉錄因子蛋白NAC編碼基因與pGreen同源重組...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蘇彥華，金曼，楊順瑛，
申請(專利權)人：中國科學院南京土壤研究所，
類型：發明
國別省市：江蘇,32