本發明專利技術涉及一種環狀的合成多肽PV及其抗菌應用。本發明專利技術所涉及的環狀的合成多肽PV分別具有序列列表中SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列及結構特征；環狀的合成多肽PV衍生自序列列表中SEQ?ID?No.2所示LBDv活性多肽；經對本發明專利技術涉及的環狀的合成多肽PV進行生物功能體外驗證，證實其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長或增殖均具有很強的抑制作用。
Modified cyclic polypeptide PV and its application and antibacterial preparation
The present invention relates to a cyclic synthetic polypeptide PV and its antibacterial application. The synthesis of cyclic peptide PV of the invention respectively with the amino acid sequence and structure characteristics of SEQ ID sequence in the list shown in the No.1; synthetic peptide PV cyclic sequence derived from the list of SEQ ID No.2 LBDv shown by synthesis of bioactive peptides; cyclic peptide PV of the invention relates to the biological in vitro functional verification, confirmed the gram positive and gram negative bacteria growth or proliferation have very strong inhibition.
【技術實現步驟摘要】
一種改造環狀多肽PV及其應用和抗菌制劑
本專利技術涉及一種環狀的合成多肽PV及其抗菌應用，具體地說是一種合成的衍生自LBDv活性多肽的結構改造環狀多肽及其抗菌應用。
技術介紹
對蝦的養殖在我國的水產養殖業中占有重要地位，近些年來，對蝦養殖過程中的病害問題已經嚴重阻礙了其養殖生產的健康發展，抗生素的濫用與環境的惡化使海水養殖動物的病害難以從根本上得到控制。抗菌肽(蛋白)被認為是魚、蝦、貝等防御細菌、病毒等外源病原感染的重要效應分子，在動物的先天免疫過程中發揮重要作用。目前從甲殼動物中發現的抗菌肽種類繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次從中國鱟(Tachypleustridentatus)和北美鱟(Limuluspolyphemus)的血細胞中分離得到ALF，并發現其能抑制LPS介導的凝血反應的激活。1985年，Morita等發現ALF還具有很強的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節對蝦(Penaeusmonodon)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、桃紅對蝦(Farfantepenaeusduorarum)等多種甲殼動物中發現ALF編碼基因的存在，并證實ALF基因的重組蛋白具有廣泛的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長的活性。另外，研究還發現對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預先與重組表達的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能明顯抑制注入蝦體中的WSSV的復制。與傳統抗生素的作用機理不同，ALF能直接中和細菌細胞壁的脂多糖，溶解細菌，因此不易引起細菌的耐藥性。ALF抗病毒的作用機理目前尚不清楚。隨著抗生素的應用，許多病原菌對現有抗生素逐步產生耐藥性，而新型抗生素的發現又極其困難，因此，ALF的研究為開發新型抗菌藥物提供了重要基礎。研究發現，ALF氨基酸序列中的兩個保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，這兩個半胱氨酸之間的氨基酸共同組成一段陰離子多肽，具有與LPS結合的能力，這段保守的結構被命名為LPS結合結構域，被認為是ALF降解革蘭氏陰性菌細胞壁脂多糖的功能域。2011年，SachinSharma等研究了根據鋸緣青蟹(Scyllaserrata)ALF的LPS結合結構域合成的具24個氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過程中作用，發現合成多肽SsALF24具有結合LPS的活性并且對大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16～32.32uM(SharmaS，YederyRD，PatgaonkarMS，SelvaakumarC，ReddyKV.AntibacterialactivityofasyntheticpeptidethatmimicstheLPSbindingdomainofIndianmudcrab，Scyllaserrataanti-lipopolysaccharidefactor(SsALF)alsoinvolvedinthemodulationofvaginalimmunefunctionsthroughNF-kBsignaling.Microbialpathogenesis2011；50∶179-191.)。前期研究發現，中國明對蝦中ALF的LPS結合結構域具有不同的抗菌抗病毒作用，通過中國明對蝦ALF的LPS結合結構域改造獲得的LBDv多肽分子表現出顯著的抗菌抗病毒作用(YangH，LiSH，LiFH，XiangJH.StructureandbioactivityofamodifiedpeptidederivedfromtheLPS-bindingdomainofananti-lipopolysaccharidefactor(alf)ofshrimp.Mar.Drugs2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。基于發表的活性多肽LBDv的氨基酸序列，本專利技術對其序列進行氨基酸替換、序列縮短等進一步改造，利用化學合成的方法獲得了改造后的環形多肽PV，它們顯示出顯著的抗菌生物學活性，具有重要的應用前景。
技術實現思路
本專利技術旨在提供一種經過結構改造的環狀合成多肽PV，它們具有明顯的抗菌活性。本專利技術的技術方案如下：利用化學合成的方法獲得了環狀的合成多肽PV，具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，其序列特征為：SEQIDNo.1：Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2所述的環狀的合成多肽PV序列具有二硫鍵結構。其結構特征在于：合成多肽PV的氨基端第一個半胱氨酸(C)和羧基端第一個半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結構；多肽的氨基端C的氨基被乙酰化(Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH2)。所述的環狀合成多肽PV衍生自活性多肽LBDv的結構改造。LBDv的特征在于：具有序列列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。所述的環狀的合成多肽PV具有明顯的抗菌活性。具體為：對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長或增殖均具有很強的抑制作用。所述環狀的合成多肽PV可作為抗菌的活性成份，可用于制備抗菌的藥物或制劑中。本專利技術有如下優點1、本專利技術確定了一種衍生自活性多肽LBDv結構改造的抗菌多肽PV及其結構特征。2、通過本專利技術可開發有效的細菌類疾病的防治藥物。附圖說明圖1合成多肽PV的空間結構圖；圖2合成多肽PV的HPLC純度檢測圖；圖3合成多肽PV的MS質譜鑒定圖。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步詳細說明。一種化學合成的具有明顯抗菌活性的對蝦環狀多肽PV，它們的序列及來源序列信息如下：(1)SEQIDNo.1的信息(a)序列特征*長度：16氨基酸*類型：氨基酸*鏈型：單鏈*拓撲結構：環形，兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵*空間結構：兩個半胱氨酸之間通過二硫鍵相連接，形成環狀結構，具有圖1所示空間結構：多肽序列形成兩個相連的β折疊結構。(b)分子類型：蛋白序列描述：SEQIDNo.1Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2其中括號內的氨基酸為成環的氨基酸，括號外左側的小寫c表示括號內的氨基酸為形成環狀結構氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸C的羧基被酰胺化。(2)SEQIDNo.2的信息(a)序列特征*長度：24氨基酸*類型：氨基酸*鏈型：單鏈*拓撲結構：環形，兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵(b)分子類型：蛋白序列描述：SEQIDNo.2Ac-Yc(CKFRVKPKFKRWRLRFKGRMWC)P-NH2所述抗菌多肽PV的合成、環化、純化、鑒定及生物活性分析：通過人工化學合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經固相環化、質譜鑒定和液相色譜純化獲得含有二硫鍵的合成多肽PV。具體為：1)多肽合成采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用10mgRink-Amide-Resin樹脂(AAPPTec，貨號RRZ001)作為載體，依靠載體本身的活性基團與5mg被Fmoc進行氨基保護的第一個氨基酸(Fmoc-Pro-NH2)的羧基相連(詳細方法參考文獻：PanagiotisStatho本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種環狀的合成多肽PV，其特征在于：所述的環狀的合成多肽PV序列具有二硫鍵結構，多肽PV的氨基端第一個氨基酸殘基(半胱氨酸，C)和羧基端第一個氨基酸殘基(半胱氨酸，C)之間具有二硫鍵結構；序列為SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種環狀的合成多肽PV，其特征在于：所述的環狀的合成多肽PV序列具有二硫鍵結構，多肽PV的氨基端第一個氨基酸殘基(半胱氨酸，C)和羧基端第一個氨基酸殘基(半胱氨酸，C)之間具有二硫鍵結構；序列為SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。2.按照權利要求1所述的環狀的合成多肽PV，其特征在于：SEQIDNo.1為Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH2。3.按照權利要求1所述的環狀的合成多肽PV，其特征在于：所述的環狀的合成多肽PV衍生自LBDv活性多肽序列的結構改造，LBDv具有序列列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。4.一...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李詩豪，李富花，相建海，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：山東,37
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