FOXC1基因H446HG突變體及其應用制造技術

FOXC1基因H446HG突變體及其應用，所述突變位于第446個氨基酸組氨酸之后插入一個甘氨酸，該突變可用于制備兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒。本發明專利技術首次從遺傳學角度篩選與兒童急性淋巴細胞白血病發生相關的T細胞突變，從分子水平為兒童急性淋巴細胞白血病早期篩查提供了新的方向，提供FOXC1基因H446HG突變在制備兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒中的應用，具有重大的實用價值和應用前景。

FOXC1 gene H446HG mutant and uses thereof

FOXC1 gene H446HG mutant and its application, the mutation is located after 446th amino acid histidine inserted into a glycine, the mutation can be used to prepare children's acute lymphoblastic leukemia screening kit. This invention is the first screening of genetically associated with childhood acute lymphoblastic leukemia T cell mutation at the molecular level, provides a new direction for early screening of children with acute lymphoblastic leukemia, FOXC1 gene H446HG mutation was used in children with acute lymphoblastic leukemia screening kit in the system, has great practical value and application prospect.

【技術實現步驟摘要】
FOXC1基因H446HG突變體及其應用
：本專利技術屬于分子生物學基因檢測
，具體涉及FOXC1基因H446HG突變體及其在兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒中的應用。
技術介紹
：急性白血病是危害兒童健康的重大疾病之一，為造血干細胞在分化過程中于某一階段出現阻滯的一種惡性增殖疾病，其中急性淋巴細胞性白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)更是兒童最常見的惡性血液病，約占白血病的75％。隨著兒童ALL診斷與治療方案的不斷完善，多種藥物聯合治療、支持治療及造血干細胞移植的應用，其5年無病生存率已超過80-90％，成為一種可以治愈的惡性腫瘤。但是，仍然有相當部分的ALL病人因治療無效或復發而死亡。化學因素、放射因素、遺傳因素及免疫因素等在白血病的發病中發揮著重要作用，其中免疫系統在腫瘤的發生發展過程中扮演了非常復雜的角色，ALL患兒免疫功能紊亂是其發生難治復發和死亡率較高的一個重要原因之一。研究者已經發現，T細胞免疫及其調節網絡異常是ALL發病和轉歸過程中的一個重要參與因素。炎癥以及腫瘤使得環境中的抑制型調節性T細胞數量(RegμLatoryTcells,Treg)大大增加,Treg會分泌大量抑制型細胞因子(TGF，IL10等)來抑制免疫反應。研究顯示，Treg細胞亞群在多種血液系統惡性疾病包括ALL患兒中的比例較正常人顯著升高，同時，Treg在ALL患兒中的異常分布也被鑒定與患者預后較差密切相關。在白血病的發生發展過程中，Treg可以通過分泌CD25抑制IL-2依賴的其他效應T細胞(EffectorTcell,Teff)的抗腫瘤效應。而在針對白血病的免疫治療中，由特異性白血病細胞負載的DC-CIK治療后，ALL患者外周中Treg分布明顯下降。雖然針對Treg在兒童ALL發生發展中的免疫抑制效應及促瘤作用已逐漸被研究者所闡明，但在兒童ALL的發生過程中促進Treg分化增加的具體調控機制仍不明確。遺傳因素及環境因素在兒童ALL的發生中具有重要的聯系，本課題組也已篩選出一系列在環境誘導的兒童ALL發生中具有潛在患病風險的特異性突變位點以及單核苷酸多態性位點，揭示遺傳因素在兒童ALL發病中的重要作用。而在針對兒童ALL發病過程中Treg分化增加的機制研究中，已有研究者發現在T細胞分化過程中，基因組特異性基因產生的突變會導致T細胞異常分化。但目前為止，從遺傳學角度探索兒童ALL發病過程中Treg分布異常增加的調控機制尚未見報道。因此，深入研究兒童ALL的發病機制，可以為發現新的生物學標志及新的靶向治療位點提供堅實的理論基礎，也可以為兒童ALL提供新的診斷和治療依據。
技術實現思路
：解決的技術問題：本專利技術的目的在于針對T細胞中是否存在相關突變與兒童ALL發生相關的問題，提供一種FOXC1基因H446HG突變體及其應用，通過全外顯子測序技術對比分析ALL患兒T細胞突變和正常對照T細胞突變，篩選出ALL特異性的T細胞突變，為臨床上兒童ALL患者的早期診斷提供新的方法。技術方案：FOXC1基因H446HG突變體，所述突變位于第446個氨基酸組氨酸之后插入一個甘氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。FOXC1基因H446HG突變體，所述突變位于1337位之后插入了核苷酸CGG(c.1337A>ACGG)，其核酸序列如SEQIDNO.4所示。上述突變體在制備兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒中的應用。檢測上述FOXC1基因H446HG突變的引物對，如SEQIDNO.1所示的上游引物：5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’，SEQIDNO.2所示的下游引物：5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。檢測上述FOXC1基因H446HG突變的探針，核酸序列如SEQIDNO.2所示。兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒，含有上述探針。優選的，上述試劑盒還含有上述引物對。優選的，上述試劑盒還含有PCR技術所需的試劑。本專利技術所述的FOXC1基因H446HG突變通過下述步驟獲得：1)采集標本：收集新發急性淋巴細胞白血病患兒和特發性血小板減少性紫癜患兒的骨髓1-2mL，原代分離培養T淋巴細胞；2)提取T淋巴細胞基因組DNA，通過全基因組外顯子測序，對比分析急性淋巴細胞白血病患兒和特發性血小板減少性紫癜患兒的T細胞測序結果，篩選出兒童急性淋巴細胞白血病特異性的T細胞突變；3)擴大樣本量采用Sanger測序法對候選T細胞突變進行驗證，在更大樣本中驗證篩選ALL特異性的T細胞突變。FOXC1基因H446HG突變檢測方法1)提取原代分離T淋巴細胞基因組DNA；2)PCR擴增；3)回收并純化所擴增的PCR片段；4)采用Sanger法測定所純化的PCR擴增片段序列，得到樣本測序序列；5)用FOXC1基因標準序列與樣本測序序列比對，分析FOXC1檢測位點突變型類別。有益效果：本專利技術首次從遺傳學角度篩選與兒童急性淋巴細胞白血病發生相關的T細胞突變，從分子水平為兒童急性淋巴細胞白血病早期篩查提供了新的方向，提供FOXC1基因H446HG突變在制備兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒中的應用，具有重大的實用價值和應用前景。附圖說明圖1為Sanger法檢測FOXC1野生型及突變型中具體堿基變化示意圖。具體實施方式以下通過實施例對本專利技術作進一步的闡述。本實施力在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本專利技術的包含范圍不限于下述的實施例。下面的實施例中未注明的條件和方法等均按照常規或者制造廠商所建議的條件進行。實施例1：研究對象的選擇和骨髓樣本收集所有病例骨髓樣本來自南京醫科大學附屬兒童醫院血液腫瘤科經MICM分型明確診斷的新發白血病患者，胸骨穿刺采集1-2mL新鮮骨髓。所有對照骨髓標本來自新發特發性血小板減少性紫癜(ATP)患者。樣本的收集和DNA提?。?).采集新發兒童ALL患者骨髓和新發ITP患者的骨髓(對照)1-2mL，在生物安全柜內通過Ficoll法原代分離浸潤性淋巴細胞。2).取兩支15mL離心管，首先分別在每只管中加入Ficoll-paquePLUS試劑5mL，然后用滴管把5mL血液沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。3).Eppendorfcentrifuge5810R離心機，22℃，500g，離心30min，加速度1，減速度0。4).離心后管內分為四層，上層為血漿，最下層主要為紅細胞和粒細胞。第二層為淋巴細胞分離液，在二、三層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。5).用1mL移液槍先把上層血清吸掉，然后吸取中間的白色云霧狀狹窄帶所包含的細胞，至另一只15mL的離心管中。6).加入5倍以上體積的TexMACSGMPMedium培養液(一般加至10mL左右)，1500rpm×10分鐘，加減速度各為5，洗滌細胞兩次。7).倒掉上清液，加入10mLTexMACSGMPMedium和20μL人源性IL-2于10cm培養皿進行體外擴增。8).72h后收集細胞提取DNA，DNA的提取參照QIAGENDNA提取試劑盒的操作步驟進行。Agilent全外顯子捕獲測序和數據分析從現有的標本中選取3例白血病患者和2例對照DN本文檔來自技高網...

【技術保護點】
FOXC1基因H446HG突變體編碼的蛋白，其特征在于所述突變位于第446個氨基酸組氨酸之后插入一個甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

【技術特征摘要】
1.FOXC1基因H446HG突變體編碼的蛋白，其特征在于所述突變位于第446個氨基酸組氨酸之后插入一個甘氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.FOXC1基因H446HG突變體，其特征在于所述突變位于1338位之后插入了CGG，其核酸序列如SEQIDNO.4所示。3.權利要求2所述突變體在制備兒童急性淋巴細胞白血病篩查試劑盒中的應用。4.檢測權利要求2所述FOXC1基因H446HG突變的引物對，其特征在于如SEQIDNO.1所示的上游引物：5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：方擁軍，薛瑤，王婭萍，康美云，戎留成，王美林，
申請(專利權)人：南京醫科大學附屬兒童醫院，
類型：發明
國別省市：江蘇,32