一種藻藍蛋白的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種藻藍蛋白的制備方法，以鮮藻為原料，首先提取粗濾液，鮮藻脫水后，加入緩沖液，混勻，然后置－２０℃～－１０℃冰凍，凍結后，取出置室溫下融溶，凍融３－５次，用板框過濾；其次是超濾純化，用截留分子量為十萬道爾頓的超濾膜，經過微濾的粗提液使分子量在十萬道爾頓以下各種物質，透過超濾膜而被清除；第三是靜置－澄清純化，經過超濾純化的藻藍蛋白的分部，除去分子量十萬道爾頓以下小分子，同時進行濃縮，經濃縮的藻藍蛋白分部在３－５℃保藏；第四是羥基磷灰石柱層析純化。本發明專利技術方法簡便，純化和濃縮效率高，具有社會、環境和經濟效益。（*該技術在2019年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及食品、化工、環境保護領域，更具體涉及。近年來，有些湖泊由于嚴重的富營養化，導致藍藻水華的大量滋生，這些藍藻水華在解體過程中會加速富營養化，而且其中還可能含有產生毒素的藍藻，它們產生多種損害人類肝臟的毒素嚴重威脅人們的健康。如昆明滇池是昆明地區唯一的飲水源，滇池藍藻水華的年生物量達萬噸級，相當可怕，必須除去，化害為利，化廢為寶，把其中有利的藻藍蛋白提出來，變成可食用的天然色素。經檢索未見到一種藻藍蛋白制備方法公開或使用。日本的一家化學品公司是世界上唯一大規模從事食用色素級藻藍蛋白產品生產及經銷的公司，它提取藻藍蛋白的方法已申請專利保護，使用螺旋藻干粉添加緩沖溶液后，在20℃攪拌5小時。而有些文獻中發表的方法，則完全局限于實驗室規模，包括鹽析、凝膠過濾，吸附色譜，離子交換色譜，以及其它更昂貴的方法，這些方法大多不適于制備食品色素級的產品。如鹽析法在工業生產規模僅局限于某些酶(工業用酶)的生產。因為鹽析一般使用硫酸銨，鹽析所得到的蛋白中會污染上銨離子，然而即使很微量的銨離子都會影響食品的味道。再如凝膠過濾法，其一是凝膠過濾所用的各種凝膠都相當貴，除非生產價格昂貴的試劑級產品，否則因成本太高而無法承受；其二，目前大部分產品不耐壓縮，因而不能制作成工業規模的粗柱。智利的Herrera A等(1989)提出了一種從螺旋藻粉大量制備藻藍蛋白的工藝流程，先利用超濾技術進行純化，再利用活性炭吸附雜質進一步純化，然而其效率差，藻藍蛋白的純度以620nm處的光吸收與280nm的光吸收的比例(A620/A280)表示，粗提液為0.62，超濾處理后，只提高到0.72，純度僅提高16％，再經過活性炭處理，純度提高到0.77，這一工序純度僅提高6.9％，效率差。本專利技術的目的是針對上述存在的問題，提供了一種既能純化藻藍蛋白，又能除去藍藻水華中含有藍藻藻毒素的制備方法，從而變環境污染物為可利用的資源。為了達到上述的目的，本專利技術采用以下技術措施采用螺旋藻鮮藻為原料，經過離心得脫水藻糊，加同等體積的磷酸緩沖液(PH6.8)，凍融3-5次，離心，棄去沉淀，收集上清，即為藻藍蛋白粗提液，純度為(A620/A280)為0.6左右。然后經過微濾預處理及超濾純化處理，得到的藻藍蛋白的純度超過1.00，濃度提高7倍，色彩鮮艷，呈寶石藍色，可直接分裝成液態濃縮食用色素。經冷卻干燥，獲得固態藻藍蛋白的食用色素，重溶性好。每100克干重的鮮藻，可提取4-10克藻藍蛋白。其步驟是A、提取粗提液，采用凍融法處理鮮藻藻糊，在冷凍過程中，藻細胞周圍的水先結冰，這種冰晶會刺破或擠壓破藻細胞，從而使藻細胞內的藻藍蛋白溶出。B、超濾工序(純化、去毒)，化工行業使用一種超濾設備，在蛋白質化工中主要用于濃縮，對粗提液進行純化。超濾設備的主要部件是超濾膜，制造商可以控制這種膜的孔徑，使這種小孔只允許“小”的分子通過，“大”的分子則被截留。這樣，“大”分子和“小”分子便分開了，得到了“小”分子組份和“大”分子組份，從而進行了純化，而被截留的部分則同時被濃縮。使用截留孔徑為10萬道爾頓的超濾膜，可除去分子量小于10萬道爾頓的各種分子，其中包括毒素，藍藻毒素的分子量在1千左右，所以很容易除去，藻藍蛋白則被截留，既被純化，又除去了藍藻毒素，且被濃縮，以便下道工序進行。C、靜止-澄清純化工序，經超濾工序后，分子量大于10萬道爾頓的大分子被濃縮。在3-5℃靜置時，一部分被濃縮的雜蛋白形成絮狀沉淀，從溶液中析出。此時，只要經過離心，棄去沉淀，收集上清，便去除了這部分沉淀的雜蛋白，藻藍蛋白的純度使得以提高。D、羥基磷灰石層析工序(純化)，羥基磷灰石層析工藝在化工行業被廣泛地使用。原理是使用其對一些不同結構的分子吸附能力不同，然后用濃度不同的洗脫液，分步洗脫，一類物質在低濃度的洗脫液中被洗脫出來，而另一類物質在較高濃度的洗脫液中被洗脫出來。羥基磷灰石對別藻藍蛋白吸附力較強，對藻藍蛋白吸附力較弱，因而，在低濃度洗脫液洗脫時得到鮮艷的寶石藍色的藻藍蛋白分部分，在高濃度的洗脫液洗脫時，得到灰藍色的別藻藍蛋白分部。有些藍藻水華中含別藻藍素相當多，它掩蓋了藻藍蛋白的顏色，所以必須把它們分開，從而得到二種色澤有別的色素蛋白。實施例1、提取粗提液。取藍藻鮮藻，經脫水后，加等體積的緩沖液(PH5.0-9.0)，混勻，然后置-20℃～-10℃冰凍，待凍結之后，取出置室溫下使之融溶，凍融處理3-5次，絕大部分藻藍蛋白被從細胞內提取出來，然后利用板框過濾或離心分離法，使粗提液與細胞碎片相分離。2、微濾、預處理。使用孔徑為2-3μm和0.45-0.22μm的二種微濾單元，對藻藍蛋白的粗提液進行微濾處理。然后進一步去除粗提物中的細胞膜碎片，避免它們堵塞超濾膜。同時經過0.22μm微濾膜濾過之后，可清除掉粗提物中的微生物，防止在以下加工過程中微生物的分解作用。3、超濾純化工序。使用截留分子量為十萬道爾頓的超濾膜設備，處理經過微濾處理的粗提液，分子量在十萬道爾頓以下的各種物質，包括小分子量的雜蛋白，小分子的有機物，多肽，及其它無機小分子，如分子量1千左右的藍藻毒素，均透過超濾膜而被清除，而藻藍蛋白及其它分子量大于10萬道爾頓的分子則滯留在超濾膜內。這樣，藻藍蛋白的純度得以提高。藍藻水華的干燥粉的粗提物為例，其純度為0.39，經過超濾純化后，純度提高到1.00-1.20，提高到原來的256-308％。4、靜置-澄清純化工序。經過超濾純化的藻藍蛋白分部，由于除去了分子量十萬道爾頓以下的小分子，所以，也同時進行了濃縮。這種經濃縮的藻藍蛋白分部在3-5℃保藏2-3天后，便會出現一些絮狀沉淀，這是淡黃色的，是雜蛋白形成的沉淀。只要經過離心或過濾處理，可以很容易地除掉這一部分雜蛋白，從而使產品純度從1.0-1.20提高到1.40-1.50。5、羥基磷灰石柱層析純化工序。在藍藻水華的提取物中，除含有藻藍蛋白外，還含有一種別藻藍蛋白，別藻藍蛋白呈灰藍色，它掩蓋了藻藍蛋白鮮艷的寶石藍色。采用實驗室常用的羥基磷灰石柱層析法，使二種物質分開。將通過靜置-澄清純化工藝處理的材料上羥基磷灰石柱，使柱的1/3著染，然后用0.001-0.25M不同濃度的磷酸緩沖液分步洗脫，共分5個不同濃度洗脫，每步1個柱體積。先可得到色彩鮮艷的寶石藍色分部，這就是藻藍蛋白分部，在0.125-0.25M濃度的洗脫液洗脫時，灰藍色蛋白的別藻藍蛋白才洗脫下來。經過此工序，藻藍蛋白分部的純度可提高到1.6-2.0，至此，產品純度遠超過食用色素級的標準。本專利技術與現有技術相比，具有以下優點和效果方法簡便，適應不同來源的藍藻資源，變害為利，變廢為寶，純化效率和濃縮效率高，與國外同行相比，提高了十倍，投資小，成本低，具有社會、環境和經濟效益。權利要求1.，其特征是A、提取粗濾液，鮮藻脫水后，加入緩沖液(PH5.0-9.0)，混勻，然后置-20℃～-10℃冰凍，凍結后，取出置室溫下融溶，凍融3-5次，用板框過濾；B、超濾純化，采用截留分子量為十萬道爾頓的超濾膜，經過微濾的粗提液，使分子量在十萬道爾頓以下各種物質，透過超濾膜而被清除；C、靜置-澄清純化，經過超濾純化的藻藍蛋白的分部，除去了分子量十萬道爾頓以下的小分子，同時進行濃縮，經濃縮的藻藍蛋白分部在本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種藻藍蛋白的制備方法，其特征是：Ａ、提取粗濾液，鮮藻脫水后，加入緩沖液（ＰＨ５．０－９．０），混勻，然后置－２０℃～－１０℃冰凍，凍結后，取出置室溫下融溶，凍融３－５次，用板框過濾；Ｂ、超濾純化，采用截留分子量為十萬道爾頓的超濾膜 ，經過微濾的粗提液，使分子量在十萬道爾頓以下各種物質，透過超濾膜而被清除；Ｃ、靜置－澄清純化，經過超濾純化的藻藍蛋白的分部，除去了分子量十萬道爾頓以下的小分子，同時進行濃縮，經濃縮的藻藍蛋白分部在３－５℃保藏２－３天；Ｄ、羥基磷灰石 柱層析純化，通過靜置－澄清的材料上羥基磷灰石柱，使柱的１／３著染，用０．００１－０．２５Ｍ濃度的磷酸緩沖液分步洗脫。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：金傳蔭，劉永定，王高鴻，沈強，何家菀，宋立榮，
申請(專利權)人：中國科學院水生生物研究所，
類型：發明
國別省市：83[中國|武漢]