一種有效凈化水質的益生菌制備方法技術

本發明專利技術公開了一種有效凈化水質的益生菌制備方法，其方法是：從對蝦養殖池中采集水樣、底泥、糞便樣品以及對蝦腸道中分離篩選芽胞桿菌菌群，經過80℃水浴、氨氮培養基篩選得到菌株，再用形態學特征、生理生化特性結果和16S?rDNA進行鑒定，通過安全性試驗對其進行初步研究，篩選出具有優良特性的土著海水芽孢桿菌；本發明專利技術篩選出的芽孢桿菌可以降低水中氨氮和亞硝酸鹽的含量，進而對對蝦體內免疫酶活性產生影響，也能夠起到促進對蝦機體免疫能力的作用，其在微生態制劑應用中具有廣闊的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
一種有效凈化水質的益生菌制備方法
本專利技術涉及的是水產養殖
，具體的說是一種有效凈化水質的益生菌制備方法。
技術介紹
隨著水產養殖業的迅猛發展，集約式養殖規模日益擴大，由于該模式養殖密度高，投喂量大，再加上投喂方式不合理，導致大量的飼料殘留，使水體富營養化，藻類過度繁殖而導致養殖水體嚴重缺氧，同時養殖動物糞便及殘體沉積水中，在厭氧環境下被分解產生硫化氫、氨氮、亞硝酸鹽等有毒中間物質，導致水質惡化，有害微生物滋生，嚴重影響我國水產養殖業的長遠發展。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的缺陷和不足，提供了一種有效凈化水質的益生菌制備方法，芽孢桿菌能迅速降解養殖池中的有機物，有效改良水質，而且芽孢桿菌還具有無毒副作用、無殘留、不產生抗藥性、穩定性好等優勢。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：一種有效凈化水質的益生菌制備方法，其方法是：從對蝦養殖池中采集水樣、底泥、糞便樣品以及對蝦腸道中分離篩選芽胞桿菌菌群，經過80℃水浴、氨氮培養基篩選得到菌株，再用形態學特征、生理生化特性結果和16SrDNA進行鑒定，通過安全性試驗對其進行初步研究，篩選出具有優良特性的土著海水芽孢桿菌。本專利技術的有益效果為：篩選出的芽孢桿菌可以降低水中氨氮和亞硝酸鹽的含量，進而對對蝦體內免疫酶活性產生影響，也能夠起到促進對蝦機體免疫能力的作用，其在微生態制劑應用中具有廣闊的應用前景。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本專利技術篩選的JNSY1菌株對養殖水體氨氮含量的影響；圖2是本專利技術篩選的JNSY1菌株對養殖水體亞硝酸鹽含量的影響；具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及具體實施方式，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施方式僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。一、菌株分離和篩選：(1)、取5g樣品，加入盛有45ml無菌生理鹽水的三角瓶中。懸浮液于80℃下保持20min，殺死不能形成芽孢的其他菌體。(2)、取5ml處理過的懸浮液接入到裝有45ml富集培養基的三角瓶內，37℃富集培養24h～48h。(3)、取1ml富集培養后的菌液，用無菌水稀釋梯度至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，稀釋度為10-6、10-7的菌懸液各取100μL涂布在分離培養基上，37℃培養24h。(4)、挑選生長良好的菌落劃線分離，重復2-3次后挑選優勢菌落4℃斜面保存待用。(5)、得到的各芽孢桿菌菌株，用1％的無菌生理鹽水稀釋后，將稀釋的菌液用涂布棒平板涂布到氨氮降解菌篩選培養基上，30℃，24h培養，觀察菌種長勢，挑取菌落大、生長速度快的優勢菌株保種備用。(6)、經過富集、分離和純化，得到8株細菌，分別編號為HDSY1、YKSY1、JNSY1、YKCD1、HDCD1、JDCD1、HDFB1、JNFB1和YKFB1。經活化后的8株菌接種到篩選培養基上，30℃培養24h后，觀察發現菌株JNSY1菌落大、生長速度快。因此選擇JNSY1為試驗菌株。二、菌株鑒定：1、挑取單菌落純化，在營養瓊脂培養基上染色鏡檢，JNSY1菌株單菌落為白蠟狀表面光滑的乳白色圓形突起，直徑約2mm；革蘭染色為陽性，呈長桿狀。2、取1ml富集菌落培養液于離心管中，12000r/min離心5min。去掉上清液然后加入100ul無菌水混合，100℃水浴加熱10min，冰浴2min，12000r/min離心5min，上清液即為該菌DNA模板。PCR擴增體系：反應體積為11μL，包括5μL10×buffer，1μLdNTPs，正反向引物各1.5μL，1μL模板DNA，1μLTaqDNA聚合酶。擴增條件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，35個循環；72℃7min。(正向引物為27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，反向引物1492R：5’－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3’)。擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將擴增產物交由中科院微生物研究所菌種保藏中心進行測序鑒定，所得序列提交至美國國立生物信息中心進行Blast同源性比對，16SrDNA序列結果比對可知蠟樣芽孢桿菌相似性為99.9％，屬蠟樣芽孢桿菌屬，結合其形態學及生理生化特征，菌種JNSY1確定為蠟樣芽孢桿菌。三、安全性試驗：(1)、將JNSY1菌株培養液分別加入凡納濱對蝦的養殖水體中，使水體細菌的最終濃度分別調至為108、107、106cfu/mL，標記為試驗組；并設置2個對照組，對照組水體中分別投放滅菌生理鹽水和108cfu/mL嗜水氣單胞菌的菌懸液，每組設2個平行，試驗過程中保證正常的換水，每天投喂1次飼料，并且連續充氣。(2)、觀察發現14d后，凡納濱對蝦養殖箱中試驗組和對照組中接種無菌生理鹽水的對蝦都能正常活動和攝食，存活率均為100％。檢查解剖隨機抽取的凡納濱對蝦，發現菌株JNSY1沒有引起對蝦的異常反應；而對照組中接種了嗜水氣單胞菌后對蝦成活率僅為48％，故認為蠟樣芽孢桿菌JNSY1對對蝦是安全的。四、水質凈化效果：1、從養殖場取樣的污泥加入1L蒸餾水制成污泥浸出液，把濃度為108cfu/mL菌株JNSY1的菌懸液接入污泥浸出液中，使水中菌液的最終濃度為107cfu/mL。2、室溫條件下靜置培養10d，設1個平行試驗，每隔2d用納氏試劑比色法測定氨氮的含量，水質凈化試驗氨氮濃度的測定結果(見圖1)。試驗組氨氮的濃度從2.26μg/mL降到0.78μg/mL，下降明顯，降解率達65.5％；而對照組中氨氮濃度呈緩慢下降趨勢，從2.19μg/mL降到1.77μg/mL，下降19.2％。說明蠟樣芽孢桿菌JNSY1能有效降解水體中氨氮。3、且每隔2d用α-萘胺比色法測定亞硝酸鹽的含量，水質凈化試驗氨氮濃度的測定結果(見圖2)。試驗組亞硝酸鹽濃度明顯下降，降解率達68.3％；對照組亞硝酸鹽含量僅下降了23.5％，本試驗表明，加入菌種JNSY1菌株后，養殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽含量呈現明顯的下降趨勢，且在使用2d時效果顯著，這表明該菌種能夠有效降解氨氮和亞硝酸鹽的含量，作為微生態菌劑有很好的應用前景。對于本領域技術人員而言，顯然本專利技術不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本專利技術的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本專利技術。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本專利技術的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本專利技術內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種有效凈化水質的益生菌制備方法，其特征在于：其方法是：從對蝦養殖池中采集水樣、底泥、糞便樣品以及對蝦腸道中分離篩選芽胞桿菌菌群，經過80℃水浴、氨氮培養基篩選得到菌株，再用形態學特征、生理生化特性結果和16S?rDNA進行鑒定，通過安全性試驗對其進行初步研究，篩選出具有優良特性的土著海水芽孢桿菌。

【技術特征摘要】
1.一種有效凈化水質的益生菌制備方法，其特征在于：其方法是：從對蝦養殖池中采集水樣、底泥、糞便樣品以及對蝦腸道中分離篩選芽胞桿菌菌群，經過80℃水浴、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王文琪，徐申波，王鑫，任貽超，楊寧，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：山東,37