一種NK細胞培養基及體外擴增NK細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種NK細胞培養基，包括基礎培養基和添加物，添加物各組分及濃度為：8?12g/L人血清白蛋白、2.5?7.5mmol/L尼克酰胺、0.5?2.0μmol/L來那度胺、8?16mmol/L?HEPES。本發明專利技術還公開一種體外擴增NK細胞的方法。利用本發明專利技術的NK細胞培養基及體外擴增NK細胞的方法，可擴增出數量大、活性高、殺傷性強的NK細胞。

【技術實現步驟摘要】
一種NK細胞培養基及體外擴增NK細胞的方法
本專利技術涉及細胞培養領域，特別是涉及一種NK細胞培養基及體外擴增NK細胞的方法。
技術介紹
自然殺傷細胞（naturalkillercell，NK）是機體重要的免疫細胞，主要分布在外周血中。NK細胞作為機體防御體系的第一道防線，不僅可以在天然免疫系統發揮其主要殺瘤效應，而且在免疫反應的早期可以分泌不同的細胞因子和各種趨化因子來調節機體獲得性免疫應答，是機體發揮免疫效應不可或缺的效應細胞。NK細胞在外周血中的含量遠不能滿足臨床需要，目前主要利用細胞因子的刺激來擴增NK細胞，但上述方法擴增的NK細胞與臨床需求仍存在一定的差距。如何提供一種可擴增出大量且高活性的NK細胞的培養基，是NK細胞體外擴增領域亟待解決的問題之一。
技術實現思路
本專利技術主要解決的技術問題是提供一種NK細胞培養基及體外擴增NK細胞的方法，可擴增出數量大、活性高、殺傷性強的NK細胞。為解決上述技術問題，本專利技術提供一種NK細胞培養基，包括基礎培養基和添加物，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來那度胺、8-16mmol/LHEPES。其中，基礎培養基為MEM-alpha培養基。其中，添加物各組分及濃度為：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L來那度胺、9-15mmol/LHEPES。其中，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來那度胺、10mmol/LHEPES。為解決上述技術問題，本專利技術提供一種體外擴增NK細胞的方法，包括以下步驟：將制備的NK細胞懸于NK細胞培養基中，并將懸有NK細胞的培養基轉移至細胞培養瓶中，NK細胞的密度為4.5×106-5.5×106個/20ml；在細胞培養瓶中加入體積比為15%-25%的自體血漿及5-15μg/ml抗Her-2單克隆抗體、950-1050U/ml重組人IL-2、25-35ng/ml重組人IL-15、5-15ng/ml重組人IL-21，并將細胞培養瓶置于37℃、5%CO2的培養箱中培養；間隔預定時間補加NK細胞培養基及950-1050U/ml重組人IL-2、25-35ng/ml重組人IL-15、5-15ng/ml重組人IL-21，當培養體系為90-110ml時，將細胞懸液轉移至細胞培養袋中培養；培養預定天數后，獲得擴增的NK細胞；其中，NK細胞培養基包括基礎培養基和添加物，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來那度胺、8-16mmol/LHEPES。其中，初始懸于NK細胞培養基中的NK細胞的密度為5×106個/20ml。其中，自體血漿的濃度為體積比20%，抗Her-2單克隆抗體的濃度為10μg/ml，重組人IL-2的濃度為1000U/ml，重組人IL-15的濃度為30ng/ml，重組人IL-21的濃度為10ng/ml。其中，基礎培養基為MEM-alpha培養基。其中，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來那度胺、10mmol/LHEPES。其中，細胞培養袋為透氣細胞培養袋。本專利技術的有益效果是：區別于現有技術的情況，本專利技術的NK細胞培養基包括基礎培養基和添加物，基礎培養基為MEM-alpha培養基，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來那度胺、8-16mmol/LHEPES。通過上述培養基體外擴增NK細胞，可擴增出數量大、活性高、殺傷性強的NK細胞。附圖說明圖1是本專利技術體外擴增的NK細胞流式結果圖一；圖2是本專利技術體外擴增的NK細胞流式結果圖二。具體實施方式實施例1體外擴增NK細胞的方法如下：將制備的NK細胞懸于NK細胞培養基中，NK細胞的密度為5×106個/20ml，然后將懸有NK細胞的培養基轉移至細胞培養瓶中；在細胞培養瓶中加入體積比為20%的自體血漿及10μg/ml抗Her-2單克隆抗體、1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，然后將細胞培養瓶置于37℃、5%CO2的培養箱中培養；每隔3天補加NK細胞培養基及1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，當培養體系為100ml時，將細胞懸液轉移到1.9L細胞培養袋中繼續培養；培養14天后，從培養袋中取出細胞，獲得擴增的NK細胞。其中，細胞培養袋為透氣細胞培養袋。在本實施例中，NK細胞培養基包括基礎培養基和添加物，基礎培養基為MEM-alpha培養基，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來那度胺、10mmol/LHEPES。在本實施例中，細胞培養瓶為T75培養瓶。請參閱圖1，圖1是本實施例體外擴增的NK細胞流式結果圖，如圖1所示，由于制備的NK細胞純度沒有100%，因此還存在其他細胞的擴增。圖1分為4個象限：左上，CD（16+56）陽性、CD3陰性，此細胞即為NK細胞，占84.7%；右上，CD3陽性、CD（16+56）陽性，此細胞即為NKT細胞（既有T細胞表型，又有NK細胞表型），占10.8%；右下，CD3陽性、CD（16+56）陰性，此細胞即為T細胞，占4.27%；左下，雜細胞，占0.161%。由圖1可以看出，本實施例的擴增效果非常可觀。實施例2體外擴增NK細胞的方法如下：將制備的NK細胞懸于NK細胞培養基中，NK細胞的密度為5×106個/20ml，然后將懸有NK細胞的培養基轉移至細胞培養瓶中；在細胞培養瓶中加入體積比為20%的自體血漿及10μg/ml抗Her-2單克隆抗體、1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，然后將細胞培養瓶置于37℃、5%CO2的培養箱中培養；每隔3天補加NK細胞培養基及1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，當培養體系為100ml時，將細胞懸液轉移到1.9L細胞培養袋中繼續培養；培養14天后，從培養袋中取出細胞，獲得擴增的NK細胞。其中，細胞培養袋為透氣細胞培養袋。在本實施例中，NK細胞培養基包括基礎培養基和添加物，基礎培養基為MEM-alpha培養基，添加物各組分及濃度為：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、1.2μmol/L來那度胺、12mmol/LHEPES。在本實施例中，細胞培養瓶為T75培養瓶。請參閱圖2，圖2是本實施例體外擴增的NK細胞流式結果圖，如圖2所示，由于制備的NK細胞純度沒有100%，因此還存在其他細胞的擴增。圖2分為4個象限：左上，CD（16+56）陽性、CD3陰性，此細胞即為NK細胞，占84.9%；右上，CD3陽性、CD（16+56）陽性，此細胞即為NKT細胞（既有T細胞表型，又有NK細胞表型），占10.9%；右下，CD3陽性、CD（16+56）陰性，此細胞即為T細胞，占4.05%；左下，雜細胞本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種NK細胞培養基，其特征在于，包括基礎培養基和添加物，所述添加物各組分及濃度為：8?12g/L人血清白蛋白、2.5?7.5mmol/L尼克酰胺、0.5?2.0μmol/L來那度胺、8?16mmol/L?HEPES。

【技術特征摘要】
1.一種NK細胞培養基，其特征在于，包括基礎培養基和添加物，所述添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來那度胺、8-16mmol/LHEPES。2.根據權利要求1所述的NK細胞培養基，其特征在于，所述基礎培養基為MEM-alpha培養基。3.根據權利要求2所述的NK細胞培養基，其特征在于，所述添加物各組分及濃度為：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L來那度胺、9-15mmol/LHEPES。4.根據權利要求3所述的NK細胞培養基，其特征在于，所述添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來那度胺、10mmol/LHEPES。5.一種體外擴增NK細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：將制備的NK細胞懸于NK細胞培養基中，并將懸有NK細胞的培養基轉移至細胞培養瓶中，NK細胞的密度為4.5×106-5.5×106個/20ml；在所述細胞培養瓶中加入體積比為15%-25%的自體血漿及5-15μg/ml抗Her-2單克隆抗體、950-1050U/ml重組人IL-2、25-35ng/ml重組人IL-15、5-15ng/ml重組人IL-21，并將所述細胞培養瓶置于37℃、5%CO2的培養箱中培養；間隔預定時間補加所述NK細胞培養基及...

【專利技術屬性】
技術研發人員：于志軍，張希濤，韓艷萍，
申請(專利權)人：廣州市魯誠生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44