一株抗尼卡巴嗪殘留標志物DNC單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應用制造技術

一株抗尼卡巴嗪殘留標志物DNC單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應用，屬于食品安全免疫檢測技術領域。本發明專利技術雜交瘤細胞株GW，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.12014。抗尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）單克隆抗體，它由所述雜交瘤細胞株GW分泌產生。此細胞株GW分泌的單克隆抗體，對尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）具有較好的特異性（IC

【技術實現步驟摘要】
一株抗尼卡巴嗪殘留標志物DNC單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應用
本專利技術涉及一株抗尼卡巴嗪殘留標志物DNC單克隆抗體雜交瘤細胞株GW及其應用，屬于食品安全免疫檢測
涉及單克隆細胞株GW及其產生的抗尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）單克隆抗體。
技術介紹
尼卡巴嗪為二硝基均二苯脲和羥基二甲基嘧啶組成的1:1復合物，其中二硝基均二苯脲（DNC）被視為尼卡巴嗪殘留的標志物。作為一種廣譜、高效、性能穩定的抗球蟲飼料藥物添加劑，它具有較強的抗原蟲作用，同時對球蟲病也有一定的防治作用。主要用以預防雞盲腸球蟲(柔嫩艾美耳球蟲)和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲(小腸球蟲)。據試驗，感染球蟲后48h內用藥，能有效地抑制球蟲發育，若用藥遲過72h，則效果明顯降低。且尼卡巴嗪推薦劑量對機體對球蟲免疫力很少或沒有影響。在防治雞球蟲病的同時，它還能促進雞的生長發育，節約飼料，提高養雞的經濟效益。然而，作為抗球蟲藥物，其在家禽肌肉及組織中會造成不同程度的殘留，而大部分藥物隨糞便排出體外。這些糞便用以農業施肥，從而給生態環境帶來不利影響，進而威脅到人民的生命健康。目前檢測尼卡巴嗪的方法主要是氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、液質聯用法（LC-MS）、液相二級質譜（LC-MS/MS）等儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的尼卡巴嗪殘留檢測方法具有重要意義。酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。然而得到高特異性和檢測靈敏度的單克隆單體是免疫學檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種對尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。本專利技術提供一種抗尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的單克隆抗體對DNC具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立DNC的免疫學檢測方法。本專利技術提供一種對DNC具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體的制備方法。本專利技術的DNC單克隆抗體，是由保藏號為CGMCCNo.12014的小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞株GW所分泌。本專利技術提供的GW細胞株的制備基本步驟為：（1）免疫完全抗原的合成：稱?。?琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羥基丁二酰亞胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），將這三種藥物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，調節pH到5.0左右。在室溫活化4h之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應過夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通過透析分離偶聯產物和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；（2）異源包被的制備：稱取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL無水DMF溶解，然后逐滴加入72μL2.5%戊二醛溶液。在室溫攪拌活化30min之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應4h，即得到異源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通過透析分離偶聯產物和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；（3）小鼠的免疫：尼卡巴嗪完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。最后一次用尼卡巴嗪完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接ELISA檢測血清效價和抑制；（4）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株GW；（5）雜交瘤細胞株性質的鑒定：通過ELISA法測定靈敏度和特異性。本專利技術的有益效果：（1）本專利技術獲得的抗尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）單克隆抗體細胞株，對DNC有較好的檢測靈敏度和特異性（IC50值為5μg/L）；（2）一種新的半抗原合成的思路，在于通過衍生得到半抗原，在用異原包被進行檢測，得到靈敏度很好的單克隆抗體細胞株。生物材料保藏保藏：抗尼卡巴嗪殘留標志物（DNC）單克隆抗體雜交瘤細胞株GW已于2016年1月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.12014。該小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞株GW也屬于本專利技術的保護范圍。附圖說明圖1.單克隆細胞株GW分泌的單克隆抗體對DNC的抑制標準曲線。具體實施方式本專利技術下面的實施例僅作為本
技術實現思路
的進一步說明，不能作為本專利技術的限定內容或范圍。下面通過實施例對本專利技術作進一步說明。本專利技術通過將尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養基培養，通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對DNC有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。實施例1：雜交瘤細胞株GW的制備1、完全抗原的合成（1）免疫完全抗原的合成：稱取將Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羥基丁二酰亞胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），將這三種藥物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），調節pH到5.0左右。在室溫活化4h之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應過夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通過透析分離偶聯產物和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；（2）異源包被的制備：稱取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL無水DMF溶解，然后逐滴加入72μL2.5%戊二醛溶液。在室溫攪拌活化30min之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應4h，即得到異源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通過透析分離偶聯產物和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；2、動物免疫選擇健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取尼卡巴嗪完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株抗尼卡巴嗪單克隆抗體雜交瘤細胞株GW，保藏編號為CGMCC?No.12014?。

【技術特征摘要】
1.一株抗尼卡巴嗪單克隆抗體雜交瘤細胞株GW，保藏編號為CGMCCNo.12014。2.抗尼卡巴嗪單克隆抗體，其特征在于：它由權利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：匡華，丁西，胥傳來，徐麗廣，馬偉，吳曉玲，劉麗強，宋珊珊，鄭乾坤，
申請(專利權)人：江南大學，得利斯集團有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇,32